Bdellin-KL is a trypsin-plasmin inhibitor from Hirudo nipponia, whose N-terminal sequence was identified as a non-classical Kazal-type. A cDNA clone encoding the inhibitor was isolated by reverse transcription-PCR (RT-PCR) and 5' rapid amplification of cDNA end (RACE). The cDNA showed an open reading frame of 155 amino acids comprising one signal peptide and two separated domains. While various amino acids and all disulfide bonds are at the N-terminal domain, the remaining region, more than 65 % of total sequence, consists of distinct internal repeats such as HHEE and HHDD. To characterize the structure and function of each domain, we prepared an N-terminal fragment (amino acid residue 19-66) by limited proteolysis of the intact protein. The inhibitory activity of the region was as potent as the intact protein. This suggests that the compact domain plays an important part in inhibition action of bdellin-KL. The C-terminal domain was revealed to have a binding affinity to ions such as $Ca^{2+}$, $Zn^{2+}$, $Fe^{2+}$, and $Fe^{3+}$ without influence on the inhibitory activity. This study demonstrates that bdellin-KL can be a novel bifunctional protein with two distinct domains.
Bdellin-KL sequence, from the constructed genomic library of Korean leech, was determined for the 2109 bases. The sequence contains the open reading frame (ORF) composed of 3 exons and 2 introns. The consensus TATA box (TATAAA) was found at -26 bp from the transcription start point (tsp). The promoter region contains potential regulatory sequence motifs including CAAT boxes and GC boxes. There are also putative transcription factor binding sites for AP-1, AP-3, E box, Pit-1, and GATA-1 in the 5'-flanking region and the first intron. In the 3'-flanking region, a polyadenylation signal (AATAAA) has been identified. The information will provide a clue to the structure-function relationship of bdellin and may helpful to understand the multifunctional proteins in vivo.
한국산 거머리, Hirudo nipponia로부터 분리한 바 있는 비전형 Kazal형 trypsin-plasmin inhibitor인 bdellin-KL의 cDNA를 reverse transcription-PCR과 5´ rapid amplification of cDNA end (RACE) 방법을 이용해 얻었다. 유전자 서열분석으로부터 단백질 서열을 유추할 수 있었으며, bdellin-KL이 총 155개의 아미노산으로 이루어져 있음을 보였고, 그 중 아미노말단 signal peptide의 뒤를 잇는 두개의 도메인이 자연산으로 존재하는 bdellin-KL에 해당함을 확인하였다. 약 40여개의 아미노산으로 이루어지는 아미노말단 도메인은 3개의 이황화결합에 의해 단단한 구조를 이루는 반면, 카르복시말단 도메인은 histidine, glutamate, aspartate, glycine이 규칙적으로 배열되어 있는 서열로 이루어졌으며 random coil구조가 예상되었다. 각각의 도메인의 특성을 분석하기 위해 limited proteolysis로 아미노말단 도메인만을 분리하였고, 이 부분이 trypsin과 plasmin에 대한 저해 활성에 관여함과 동시에, 넓은 범위의pH와 온도에서도 그 저해 활성을 유지함을 보여, 작고 안정된 단백질 분해효소 저해제로 응용할 수 있는 가능성을 제시하였다. Fluorescence spectroscopy를 통해, 카르복시말단 도메인이 $Ca^{2+}$, $Zn^{2+}$, $Fe^{2+}$, $Fe^{3+}$ 과 같은 이온들과 결합할 수 있음을 확인하였으며, bdellin-KL의 저해 활성이나 단백질의 2차 구조가 이온 결합으로 인한 영향을 거의 받지 않음을 확인하였다. 이로부터 bdellin-KL은 두 개의 구분되어지는 역할, 즉 단백질 분해효소 저해 및 charged molecule에 결합하는 기능을 가지는 독특한 구조의 단백질이라고 결론지었다.
본 연구팀에서 제작한 한국산 거머리의 genomic library로부터 찾은 bdellin-KL 유전자의 서열 분석을 통해, 3 개의 exon과 2 개의 intron으로 이루어진 open reading frame과 5´, 3´ 말단 인접 부분의 구조를 밝혔다. 5´ 말단 인접 부위에서 TATA, CAAT, GC box들의 위치를 확인하였고, 조직 특이적인 발현을 조절한다고 알려져 있는 AP-1, AP-3, E box, Pit-1, GATA-1과 같은 transcription factor들이 결합 가능한 서열들을 5´ 말단 인접 부위 및 첫번째 intron안에서 찾을 수 있었다. 3´ 말단 인접 부위에서는 polyadenylation signal이 확인되었다.
본 연구를 통해 이러한 bdellin-KL의 일차구조 및 그 도메인의 특성, 그리고 유전자 구조의 이해를 통해 이 단백질이 거머리 생체내에서 가지는 기능을 유추할 수 있었다.
