In order to study transcription elongation mechamism of phage T7 RNA polymerase, stepwise walking of RNA polymerase was constructed by immobilizing biotinylated DNA template with streptavidin bead. Series of active and stable elongation complexes were obtained. Transcripts were radiolabeled at the 16th to 18th residues, and a photocross-linkable 4-thio-UMP was incorporated at the 22nd, 24th, 32nd, and 38th residues separately to identify the protein-RNA interaction in elongation complex of T7 RNA polymerase. Such complexes (up to 51 nt1) produced by the incorporation of a nucleotide at a time were isolated and subjected to long-wave UV cross-linking individually. As a result, only when the cross-linker is positioned at the 3` end (-1) of the elongating RNA and 8 nucleotides upstream (-9), it is substantially cross-linked to the polymerase, regardless how far it is from the 5 end of transcripts. Above two RNA binding sites of T7 RNA polymerase was determined using trypsin, hydroxylamine, 2-nitro-4-thiocyano benzoic acid and cyanogen bromide. Linkage of the 3`-end residue is mapped to the 636Thr-666Met region, which contains nucleotide-binding sites as previously identified. The 9 residue is cross-linked to the C-terminal 724Ala-750Met region rather than an N-terminal region as other results and models. These two contacts are maintained throughout the elongation complexes, and reveal a route of a growing RNA chain on the polymerase structure.
The results suggest that active site of T7 RNA polymerase is conserved during transcription processes from initiation to elongation. Conformation change of elongation complex from initiation to elongation is also inferred from the change of the upstream RNA-binding regions.
파아지 T7 RNA 중합효소의 전사연장 기작을 연구하기 위해 RNA 중합효소의 단계별 진행과정은 biotin이 붙어있는 DNA template를 streptavidin bead로 고정시킴으로써 구축되어졌다. 일련의 활성을 가지는 안정한 전사연장 복합체들이 얻어졌다. 전사체들은 16번부터 18번째 까지의 핵산 잔기들에 방사성 표지 되어졌으며, 광에 의해 cross-link를 이룰 수 있는 4-thio-UMP는 T7 RNA 중합효소의 전사연장 복합체에서의 단백질-RNA 상호작용을 규명하기 위해 각각 22번, 24번, 32번, 그리고 38번째 핵산 잔기들에 삽입되어졌다. 한번의 nucleotide 삽입에 의해 생성된 복합체들(51 nucleotide 까지)이 분리되어졌고, 긴 파장 UV에 의한 cross-linking 과정이 각각 수행되어졌다. 결과로서, 전사체들의 5’ 말단으로부터 얼마나 멀리 떨어져 있는가에 관계없이 cross-linker가 연장하고 있는 RNA의 3’ 말단(-1)과 8개의 nucleotides upstream(-9) 부위에 위치되어졌을 때에만 중합효소에 상당한 정도로 cross-link가 이루어졌다. T7 RNA 중합효소들의 두개의 RNA 결합 부위들은 trypsin, hydroxylamine, 2-nitro-4-thiocyano benzoic acid, 그리고 cyanogen bromide를 사용하여 결정되어졌다. 3’ 말단 핵산 잔기들의 연결은 이전에 nucleotide 결합 부위들을 포함하는 것으로 알려진 636Thr-666Met 위치에 mapping되어졌다. 이들 두 가지 접촉들은 전사연장 복합체들 전반에 걸쳐 유지되어지고, 중합효소 구조상에 있어 성장하는 RNA 사슬의 이동 경로를 밝혀주고 있다.
이러한 결과들은 T7 RNA 중합효소의 활성 부위는 개시단계부터 연장단계까지 전사과정 동안에 유지되어진다는 것을 제안한다. 개시부터 연장단계까지의 전사연장 복합체의 구조변화는 또한 upstream RNA-결합 위치들의 변화로부터 유추되어질 수 있다.
