To understand the regulation of the human mTERF gene, the 5'-flanking region was characterized. Sequence analysis revealed that it contains three exons (-1274~+37, +580~+639 and +5938~+7794) and two introns (+37~+580 and +639~+5938). This 5?region contained putative binding sites for various transcription factors. Instead of TATA or CAAT box, there were binding sites of NRF-2 factors near the transcription start site (+1). For the purpose of defining sequences that regulate expression of the mTERF, 5'-deletion mutants were cloned to the upstream region of CAT gene in promoter-less pCAT3-Basic vector. The transcriptional activities of these 5'-deletion mutants were analyzed with CAT activity after transfection into HeLa cells. Analysis of deletion mutants revealed four regions, that could contain a positive (-1274~-949), negative (-254~-59) regulatory elements, and two NRF-2 binding sites (-57 and -38), respectively. These results suggest the presence of trans-acting factors that act on these positive and negative regulatory elements and regulate the transcription of the mTERF gene. Other results confirmed that two binding sites of NRF-2 were important in the transcription of the mTERF gene. Gel mobility shift assays were performed to prove the presence of specific factors binding to these sites. The fact that GG bases, of the NRF-2 consensus sequence GGAA, determined the specificity of one band, was found by competition experiments. These results confirmed that it was made by specific interactions between some proteins and probes. From these results, the possibility that the protein interacting probes might be NRF-2 factor was very high. If so, it would provide another link between nuclear and mitochondrial gene expression regulated by not NRF-1 but NRF-2 as a major factor.
사람 미토콘드리아 전사종결 인자 유전자의 발현 조절을 이해하기 위해 유전자의 5'-말단 인접 부위를 규명하였다. 염기서열 분석은 5'-인접 부위가 세 개의 exons (-1274~+37, +580~+639, +5938~+7794) 그리고 두 개의 introns (+37~+580, +639~+5938) 부위를 포함하고 있다는 것을 밝혀주었다. 이 부위는 다양한 전사 인자들이 결합할 것으로 추정되는 부위들을 포함하고 있었다. TATA 또는 CAAT box 대신에, 전사 개시 부위에 인접하게 NRF-2 인자들이 결합할 수 있는 부위들이 존재하였다.
5'-deletion 돌연변이체들은 promoter 부위를 포함하고 있지 않는 pCAT3-Basic vector의 CAT 유전자 5'-상위 부위에 cloning되어졌다. 미토콘드리아 전사종결 인자의 발현을 조절하는 서열들을 확인하기 위할 목적으로 이들 5'-deletion 돌연변이체들을 사람의 자궁경부암 세포에 transfection한 후 각각의 전사 효율들이 분석되어졌다. 이들 deletion 돌연변이체들의 분석은 전사종결 인자 유전자의 발현에 각각 positive (-1274~-949), negative (-254~-59)하게 작용하고, 두 개의 NRF-2 결합 부위들 (-57, -38)을 포함하고 있는 네 개의 영역을 밝혀주었다. 이들 결과들은 각각의 부위에 작용하여 미토콘드리아 전사종결 인자 유전자의 전사 과정을 조절할 수 있는 전사 인자들의 존재 가능성을 강하게 제시해 주고 있다.
또 다른 결과들은 두 개의 NRF-2 인자들의 결합 부위들이 사람 미토콘드리아 전사종결 인자 유전자의 전사에 있어서 중요하다는 것을 입증해 주었다. Gel mobility shift 분석 실험들은 이들 부위들에 결합하는 특이적인 인자의 존재여부를 알아보기 위해 수행되어졌다. NRF-2 인자의 결합에 관여하는 중요 서열인 GGAA 가운데 GG 염기들이 gel상에서 한 band의 특이성을 결정한다는 사실은 competition 실험들에 의해서 밝혀졌다. 이러한 결과들은 그것이 어떠한 단백질들과 probes 사이의 특이적인 상호 작용들에 의해서 형성된 것이라는 것을 알려준다. 이러한 결과들로 미루어 볼 때, probes과 상호 작용하는 단백질이 NRF-2일 가능성이 매우 높다고 할 수 있다. 만약, 그러하다면, 그것은 NRF-1이 아닌 NRF-2가 주된 조절 인자로 작용하는 핵과 미토콘드리아 유전자 발현 사이의 또 다른 연관 관계를 제시해 줄 수 있을 것이다.
