In the present study, biochemical and molecular changes during cell death induced by selenite and Se-methylselenocysteine (MSC) were studied in human promyelocytic leukemia (HL-60) cells. Treatment of selenite and MSC decreased cell viability in a dose-dependent manner measured by WST-1. Lactate dehydrogenase leakage assay indicated that selenite caused more extensive membrane damage than MSC. Morphological observations revealed that selenite-treated cells showed mainly necrotic morphologies and MSC-treated cells exhibited apoptotic morphologies. Although both selenite and MSC induced apoptotic DNA fragmentation in a dose-dependent manner, flow cytometric analysis of apoptosis revealed that apoptotic population was much higher in MSC-treated cells. Caspase-3, -8, and -9 were activated by both selenite and MSC, but the magnitude of their activation was much smaller in selenite-treated cells than in MSC-treated cells. On the other hand, the extent of cytochrome c release was much higher in selenite-treated cells, which implies that selenite caused extensive mitochondrial damage. Caspase inhibitors, z-DEVD-fmk, z-LEHD-fmk, and z-IETD-fmk all significantly recovered the decreased viability by the treatment with MSC, while they had no effects in case of selenite-treated cells. Caspase-3 activity was completely inhibited by z-IETD-fmk, whereas inhibition by z-LEHD-fmk was partial. These results suggest that caspase activation cascade mediated by caspase-8 is required for MSC-induced cell death while selenite-induced cell death occurred irrespective of caspase activation. Intracellular calcium level was increased by selenite and MSC. Calcium channel blocker $Ni^{2+}$ could significantly lower the intracellular calcium level and increase the viability in selenite-treated cells, which indicates that calcium influx is important in selenite-induced cell death. Further investigations on DNA strand breaks suggested that selenite caused caspase-3-independent DNA double and single strand breaks, while MSC caused only caspase-3 dependent DNA double strand breaks. PARP inhibitor, 3-benzamide, facilitated the cleavage of PARP and increased the apoptosis, implying that severe activation of PARP by selenite prevented cells from apoptosis and caused necrosis. MSC increased intracellular ROS level dose- and time-dependently. This increase of ROS level was sufficiently suppressed by N-acetylcysteine. N-acetylcysteine also blocked apoptotic features induced by MSC such as cytotoxicity, DNA fragmentation, and caspase activation. These results suggested that ROS generation is a critical step during MSC-induced apoptosis.
본 연구에서는 인간 미분화 골수암 세포주(HL-60)에서 selenite와 Se-methylselenocysteine(MSC)에 의해 유도되는 세포 예정사와 생화학적 분자적 변화에 대하여 연구하였다. Selenite와 MSC의 처리에 의해 WST-1 assay에 의한 세포 생존률이 농도 의존적으로 감소하였다. LDH leakage assay에 의한 분석 결과 selenite가 MSC보다 더 큰 세포막 손상을 일으켰다. 세포 형태를 관찰한 결과 selenite를 처리한 세포들은 주로 세포 괴사의 형태적 특성을 띄었고 MSC를 처리한 세포들은 세포 예정사의 형태적 특징을 나타내었다. Selenite와 MSC의 두 경우 모두 농도 의존적으로 세포 예정사 특이적인 DNA fragmentation 현상을 나타내었으나 flow cytometry 분석법을 이용한 세포 예정사 분석 결과 MSC 처리한 세포에서 selenite를 처리한 세포의 경우보다 훨씬 높은 세포 예정사 단계의 세포비율을 얻었다. Selenite와 MSC 모두 caspase-3, caspase-8, caspase-9의 활성화를 일으켰으나 그 활성화 정도는 MSC를 처리한 세포에서 훨씬 높았다. 반면 세포질 내로의 cytochrome c의 유출은 selenite의 경우에 훨씬 높았는데 이것은 selenite가 심각한 미토콘드리아 손상을 입혔다는 것을 암시한다. Caspase 억제제인 z-DEVD-fmk, z-IETD-fmk, z-LEHD-fmk는 MSC에 의해 감소된 세포 생존률은 회복시켰으나 selenite에 의해 감소된 세포 생존률에는 영향을 미치지 않는 것으로 보아 caspase의 활성화는 MSC에 의한 세포사에는 필요하지만 selenite에 의한 세포사는 caspase 활성화와 무관하게 진행됨을 알 수 있었다. 또한 MSC에 의한 caspase activation에서 caspase-8이 가장 윗 단계에서 작용하였다. Selenite와 MSC에 의한 세포 내 칼슘의 농도가 증가됨을 관찰하였다. 칼슘 통로의 저해제인 $Ni^{2+}$에 의해 selenite를 처리한 세포의 세포 내 칼슘 농도가 감소하고 생존률이 증가하는 것으로 보아 칼슘의 세포 내 유입이 selenite에 의해 유도된 세포사에서 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다. 그리고 DNA 사슬 절단에 대해 조사한 결과 selenite는 caspase-3와 관계없이 DNA 양쪽 사슬 절단과 한쪽 사슬 절단을 일으켰으나, MSC는 caspase-3에 의해 유도되는 DNA 양쪽 사슬 절단만이 관찰되었다. 또한 selenite를 처리한 세포에서 PARP 효소 저해제인 3-AB를 처리했을 때 PARP의 절단을 촉진시키고 세포 예정사를 증가시켰는데 이는 PARP의 과다 활성화가 세포 예정사로 진행되는 것을 억제하고 세포괴사로 이어지게 한다는 것을 암시한다. MSC는 세포내의 활성산소종의 양을 농도와 시간 의존적으로 증가시켰다. 이러한 활성산소종의 양의 증가는 N-acetylcysteine에 의해 효과적으로 억제되었다. N-acetylcysteine은 또한 MSC에 의해 유도된 세포독성, DNA fragmentation, 그리고 caspase 활성화와 같은 세포예정사의 특징이 발현되는 것을 억제하였다. 이러한 결과는 MSC에 의해 유도되는 세포 예정사에서 활성산소종의 발생이 필수적인 단계임을 시사한다.
