The latency-associated nuclear antigen (LANA), encoded by the open reading frame (ORF) 73 of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV/HHV8), may be required for the persistence of viral episome by tethering it to host chromosome during mitosis. It also has been suggested that LANA may have a transcriptional regulatory activity from its amino acid sequence features. To identify cellular proteins which interact with LANA, yeast two-hybrid assay was performed using full-length LANA as a bait. Among several positive clones was a partial cDNA of activating transcription factor (ATF) 4, also known as cAMP response element (CRE) binding protein (CREB) 2 or tax-response element binding protein (TAXREB) 67. ATF4/CREB2 belongs to the ATF/CREB family of transcription factors, which share the relatively conserved basic region / leucine zipper (bZIP) domain required for DNA binding and homo-/heterodimerization, respectively. In this study, LANA and ATF4/CREB2 were shown to interact in vivo and in vitro, and the putative leucine zipper domain of LANA was required for binding to the bZIP domain of ATF4/CREB2, implicating that the interaction may involve leucine zipper dimerization. Binding of LANA to ATF4/CREB2 resulted in the repression of the transcriptional activation by ATF4/CREB2, but seemed to have no obvious effect on DNA-binding ability of ATF4/CREB2, proved by GAL4 system and electrophoretic mobility shift assay (EMSA).
CREB-binding protein (CBP) and its structural/functional homologue, p300, interact with a number of cellular transcription factors, nuclear hormone receptors, coactivators, and viral proteins, thereby participate in cell growth, transformation, and development. The result of preliminary experiment examining the transcriptional role of LANA, and the fact that both p53 and ATF4/CREB2, of which transcriptional activities has been known to be regulated by LANA, utilize CBP as a common coactivator, arose the possibility of the interaction between LANA and CBP. In this study, we also found that LANA binds to the C/H3 region of CBP, which is also targeted by adenovirus E1A and SV40 large T antigen, and thereby inhibits its interaction with other cellular factor. In addition, the augment of transcriptional activity of CBP by protein kinase A (PKA) was repressed by LANA. In in vitro histone acetyltransferase (HAT) assay, LANA inhibits HAT activity of CBP in a binding-dependent manner. These data implicate that LANA may play an important role not only in the maintenance of KSHV genome but also in the regulation of cellular/viral transcriptional network during the latent infection of KSHV.
카포시 육종 허피스 바이러스 (KSHV/HHV8)의 latency-associated nuclear antigen (LANA) 은 숙주세포 분열 시 바이러스의 지놈을 숙주세포의 염색체에 부착시킴으로써 바이러스 지놈의 유지에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 또한 일차 아미노산 서열의 여러가지 특징들로부터 LANA 가 전사조절 인자로도 작용할 것이라고 제안되어 왔다. LANA와 작용하는 숙주 세포 단백질을 알아 내기 위해 LANA 를 이용하여 yeast two-hybrid assay 를 수행하였다. 이 가운데 ATF4 혹은 CREB2, TAXREB67 등으로 불리우는 세포전사 조절인자가 LANA 와 작용하는 숙주 세포 단백질로 발견되었다. ATF4/CREB2 는 상대적으로 유사한 일차 아미노산 서열을 갖는 basic region / leucine zipper (bZIP) domain 을 공유하는 ATF/CREB family 에 속하는데, 이들 각각은 DNA 와의 결합과 homo-/heterodimerization 에 필요하다. 우리는 LANA 가 ATF4/CREB2 와 세포내 및 시험관 내에서 결합한다는 것을 확인하였고, LANA의 putative leucine zipper domain 과 ATF4/CREB2 의 bZIP domain 이 두 단백질 간의 결합에 필요하였으며, 이는 이 결합이 leucine zipper dimerization 을 통해 일어난다는 가능성을 제시한다. LANA 가 ATF4/CREB2에 결합함으로써 ATF4/CREB2에 의한 전사 촉진이 억제되었으나, GAL4 system 및 electrophoretic mobility shift assay (EMSA) 등의 실험을 통하여 ATF4/CREB2 의 DNA 결합능력에는 별 영향을 미치지 않은 것으로 판단되었다.
CREB-binding protein (CBP) 및 이와 구조적/기능적 유사 단백질인 p300은 다양한 세포 내 전사조절 인자, nuclear hormone receptor, coactivator 및 바이러스 단백질 등과 작용함으로써 세포 성장, transformation 및 발생과정에 참여한다. LANA 의 전사조절 기능을 조사하는 기초실험 결과와, LANA에 의해 그 전사기능이 조절된다고 알려진 p53과 ATF4/CREB2가 모두 CBP를 coactivator로 사용한다는 사실로 부터 LANA와 CBP 간의 상호작용의 가능성이 야기되었다. 이 연구에서, 우리는 아데노바이러스 E1A나 SV40 large T antigen 등의 바이러스 단백질과 작용하는 CBP의 C/H3 region과 LANA 가 결합하여 다른 세포내 전사조절 인자와의 작용을 방해하는 것을 발견하였다. 또한, protein kinase A (PKA)에 의해 CBP의 전사기능이 활성화되는 것을 LANA가 저해하였다. 시험관 내 CBP의 히스톤 아세틸 트랜스퍼레이즈 기능도 LANA가 결합함으로써 그 기능이 저해되었다. 이러한 실험 결과들은 LANA 가 카포시 육종 헤르페스 바이러스의 잠복기시 바이러스 지놈의 유지 뿐만 아니라 세포 및 바이러스 전사체제의 조절에 있어서도 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.
