The meta-cleavage pathway for catechol is one of the major routes for the microbial degradation of aromatic compounds. In Sphingomonas sp. DJ77, the genes for the lower pathway were previously found to be clustered as phnDEGHIJKL and their nucleotide sequences were determined. Through a nucleotide sequence analysis, the phnJ gene is thought to encode a 4-hydroxy-2-oxovalerate aldolase and the phnH gene is thought to encode a 2-hydroxypent-2,4-dienoate hydratase. The phnJ and phnH gene were cloned into expression vectors, pET and pMAL, and expressed gene products in E. coli. The proteins expressed from the pET system were mostly insoluble but those from the pMAL system were soluble. The soluble proteins were purified by an affinity chromatography. 0The enzymatic analysis with the purified proteins indicated that the phnJ gene encodes a functional 4-hydroxy-2-oxovalerate aldolase. The assay system established in this study can be used in further modification of these enzymes through protein engineering.
방향족 탄소화합물 분해 균주인 Sphingomonas sp. strain DJ77는 여타 다른 방향족 화합물 분해 균주들에 비해 넓은 기질 특이성을 가진 것으로 보고되었다. 따라서 이 균주의 방향족 화합물 대사과정에 관여하는 효소들 역시 넓은 기질 특이성을 가질 것으로 기대되는 바, 대사과정에 관여하는 효소들 중 위치선택성을 가진 효소인 4-하이드록시-2-옥소발레르산 알돌라아제와 4-하이드록시펜트-2,4-디엔산 수화효소의 유전자를 클로닝하고 이를 대장균 내에서 대량 발현시켜보았다.
단백질 발현을 위해서 이 실험에서는 두 가지 발현 시스템이 사용되었다 하나는 6개의 히스티딘 분자를 포함하는 재조합 단백질을 만드는 pET 시스템이며 또 다른 하나는 MBP를 포함하는 재조합 단백질을 만드는 pMAL 시스템이다. 그러나 pET 시스템에서는 재조합 단백질이 침전 상태로 얻어져 최종적으로 pMAL 시스템을 이용하여 재조합 단백질을 얻어낼 수 있었다. pMAL 시스템에서도 재조합 알돌라아제의 경우 37℃에서는 침전 상태로 얻어졌으나 이는 배양온도를 30℃로 낮춤으로써 해결할 수 있었다. 발현된 재조합 알돌라아제는 알돌 첨가반응을 촉매화하는 것으로 나타났다.
이 실험에서 얻어진 두 효소들은 유기 합성에 유용하게 이용될 수 있는 여러 가지 성질들을 가지고 있다. 따라서 최근 발전하고 있는 단백질 공학에서의 기술들을 이용해 이들 효소를 좀더 개량한다면 매우 효과적인 생촉매로 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 본 연구는 이들 효소를 개량하는 과정에서 반드시 필요할 것으로 생각되는 효소의 활성 측정을 위한 시스템을 제시하고 있다.
