In this study, we developed the practical processes for the production of L- tryptophan, which is widely used in food and pharmaceutical industry from indole, pyruvate and ammonia using thermostable tryptophanase from Symbiobacterium toebii.
A gene encoding thermostable tryptophanase of Symbiobacterium toebii has previously cloned.
Firstly, we employed the constitutive expression system to mass produce the thermostable tryptophanase. We established the optimal cultivation conditions for the constitutive expression system in E. coli. Obviously for a lower growth rate (μ < 0.1), intracellular conditions can be provided which are particularly favorable for expressing the heterologous protein in constitutive expression system. In this condition (μ=0.1), the final cell density reached at 35g DCW. We obtained 7.35g/L of thermostable tryptophanase, which is 42.0 % of total protein in soluble form.
Secondly, we optimized the process for the production of L-tryptophan from indole, pyruvate and ammonia using thermostable tryptophanase which previously massproduced. In order to reduce the inhibition of tryptophanase by indole, we used the whole E. coli cells highly expressing thermostable tryptophanase as a biocatalyst. Optimal temperature and pH were determined to be 37℃ and 8.5, respectively, by taking into account the reaction rate and conversion yield. Enzymatic production of L-tryptophan was carried out in bench-scale reactor. Under optimal conditions, we obtained 183g/L of L-tryptophan for 37h reaction. This value corresponds to a 97% of conversion yield for indole and an 87% yield for sodium pyruvate.
Simbiobacterium toebii 유래의 내열성 트립토파나아제(tryptophan indole-lyase)를 이용하여 indole, pyruvate, ammnonia로부터 광학적으로 순수한 L-tryptophan을 대량 생산하는 생물 전환 공정을 개발하였다
첫번째로, 내열성 트립토파나아제의 대량생산을 위하여 항시적 발현계를 도입하였다. 항시적 발현계를 이용하여 대장균내에서 재조합 단백질의 대량생산을 위하여 재조합 대장균 배양 조건을 최적화 하였다. 항시적발현계를 이용한 재조합 단백질 생산의 경우 성장속도를 낮은 상태로 조절하여 조업할 때, 가장 좋은 결과를 얻을 수 있었다. 이러한 조건하에서(비성장속도 = 0.1) 최종 균체 농도가 약 35 g DCW 에 도달하였고, 7.35 g/L 의 내열성 트립토파나아제를 얻을 수 있었다. 전체 단백질에 대한 내열성 트립토파나아제의 발현율은 약 42%였다.
두번째로, 내열성 트립토파나아제를 생물촉매로 이용하여 indole, pyruvate, ammonia 로부터 L-트립토판을 대량 생산하는 공정을 최적화 하였다. indole 에 의한 트립토파나아제의 효소저해를 줄이기 위해, 트립토파나아제가 과발현된 전세포 효소를 L-트립토판 생산반응의 생물촉매로 사용하였다. 반응 최적 온도와 pH 는 반응속도와 전환율을 고려하여 각각 37℃ 그리고 8.5 로 결정되어졌다. 최적화된 반응조건하에서 bench-scale의 효소 반응기에서 L-트립토판 생산을 수행하였다. 그 결과37시간반응 후 183 g/L의 L-트립토판을 생산할 수 있었다. 이 수치는 기질인 indole에 대한 전환율로 나타내면, 약 97% 그리고 pyruvate에 대해 약 87%에 해당하는 수치이다.
