A highly productive continuous process has been developed in this study for the production of secondary metabolites using immobilized Streptomyces cells. Kasugamycin and Streptomyces kasugaensis immobilized on celit beads were used as the model product and microbial producer, respectively. The sole carbon source was maltose. The biosynthesis of kasugamycin could be greatly enhanced by applying a non-nutritional stress of pH shock, that is, a sequential pH changes from a neutral pH to an acidic and then back to the neutral condition. During the acidic period, cell growth decreased to nil. After the recovery of the neutral condition, the cell growth resumed after a time-lag concurrently with the biosynthesis of kasugamycin at s greatly enhanced rate compared with the control case with no pH shock. The best result wasobtained when pH shock was applied for 24 h. In repeated-batch operations using immobilized cells, the increase in maltose consumption rate and decrease inkasugamycin production wereobserved with the number of batches. Even with intermittent pH shock treatment, kasugamycin production activity could be recovered only partially. In immobilized-cell separation and recycling, the operation could not be sustained for an extended period due to excessive loss of immobilized cells caused by the poor performance of the separator. In the subsequent culture with a revised separator, a stable operation could be maintained for as long as over 820 h with high kasumycin productivity. The kasumycin productivity was about 14-23 folds higher than that in a batch suspended-cell culture. When the original feeding medium was replaced with 2 fold-concentrated medium during this continuous culture, the productivity was severely impaired, and excessive formation of free cells and excessive loss of immobilized cells through the separator occurred. In another continuous run, doubling of the dilution rate (D) from $0.05h^{-1}$ increased the volumetricproductivity not due to increased specific productivity but doe to increased cell concentration in the reactor. No stable operation could be maintained due to the loss of cell-immobilized beads at $D=0.1h^{-1}$. The operation at a dilution rate of $0.2h^{-1}$ resulted in a significant decrease in the volumetric productivity and also in the specific productivity. Considering high productivity, stable operation, and efficient utilazation of substrate all together, a dilution rate of $0.05h^{-1}$ was considered to be optimum for the given bioreactor system. It was also found the reducing of the initial bead concentration resulted in a very unstable and poorly productive situation with a siginificant loss of cell-loaded beads. Intermitten supplementation of new beads did not contribute to in-situ immobilization.
이차대사산물의 장기적 연속생산을 위한 고생산성 고정화세포반응기 시스템 개발을 위한 연구를 수행하였다.
영양소원(질소, 인) 농도변화에 따른 카수가마이신 생성 거동을 조사한 결과, 초기 농도가 글리신 45mM, 인 8mM인 플라스크 배양에서 카수가마이신 생성량이 최대가 됨을 관찰하였다. 한편, 동일 배지 조건에서 buffer를 첨가하지 않은 경우에 월등히 많은 양의 카수가마이신이 생성되었다. 두 경우의 유일한 차이는 pH 변화로 관찰되었다. 따라서 pH를 제어할 수 있는 생물반응기를 이용하여 pH에 의한 영향을 체계적으로 조사하였다.
중성에서 배양시 생성된 카수가마이신의 최대량은 12.6mg/L였다. 후속 실험으로서, 초기 36시간 동안 중성조건에서 배양 후, pH를 4.0으로 급격히 강하하였다. 산성조건에서 48시간 배양 후, pH를 다시 중성조건으로 변화하였다. 이러한 pH 변화 조작을 pH shock으로 정의하였다. 생성된 카수가마이신 양은 최대 116mg/L였다. 이는 중성조건에서 얻은 값보다 9.8배 높은 수율(Y_p/s)을 나타내었다. 최적 pH shock 시간을 결정하기 위한 일련의 실험에서, 24시간일 때가 최적의 결과를 나타내었다.
고정화세포 배양을 수행하였다. 세포 고정화에 적합한 형태인 포자를 대규모로 회수하기 위한 고체 배지를 개발하였다. 고정화세포의 반복 회분식 배양을 수행하였다. 회분수의 증가에 따라 당 소모 속도가 증가하였고 커수가마이신 생성량은 급격히 감소하였다. 간헐적으로 산성조건의 최소 배지로 교체하며 반복 회분식 배양을 수행하였다. 그 결과, 초기 pH를 3.5의 buffer를 첨가하지 않은 배지를 이용한 열 번째 회분에서는 카수가마이신 생성량은 최대값의 68% 수준으로 증가함을 관찰하였다.
희석속도 0.05h^-1에서 고정화세포의 연속배양을 수행하였다. 원형(proto-type)의 고정화세포 분리기가 장착된 생물반응기를 이용한 연속실험에서 배양 400시간 이후부터 고정화세포 분리기의 분리효율이 급격히 감소함으로써 세포가 고정화된 셀라이트 비드가 다량으로 유출되었다. 이는 세포 담지량이 높은 비드를 우선적으로 유출시킴으로써 반응기내 세포농도 감소를 초래하였다. 이로 인해 카수가마이신 생산성의 감소가 관찰되었다. 개량된 고정화세포 분리기가 장착된 생물반응기를 이용하여 기존과 동일한 조건에서 연속실험을 수행하였다. 회분식 배양을 포함한 총 배양시간은 1125시간이었다. 정상상태에서의 카수가마이신 농도는 196-321mg/L에서 주기적인 변화를 보였다. 반응기내 및 유출액 중 세포농도는 19g/L와 6∼7g/L로 일정하게 유지되었다. 854시간의 연속배양 후, 반응기내의 비드 농도는 133g/L로 관찰되었다. 이는 연속배양 직후 비드농도의 82%에 해당되며 35g/L의 비드가 유실되었음을 나타낸다. 19.4g/L가 샘플링에 의한 손실이라는 것을 고려한다면, 분리기의 분리성능이 뛰어남을 보여준다. 본 실험에서 달성한 카수가마이신의 부피생산성은 회분식 배양에서 얻은 것에 비해 14∼23배 높았다. 이러한 높은 생산성 외에도, 본 고정화 반응기 시스템을 이용하여 안정적인 장기조업을 달성할 수 있었다. 2배 농축된 배지의 공급은 산소제한 조건을 유발하였고 카수가마이신 생산성의 감소를 초래하였다. 특히, 과도한 유리세포의 생성으로 인해 배양액의 점도가 증가하였을 뿐만 아니라 고정화세포분리기의 분리효율이 감소하였다. 기준배지로 교체하였음에도 불구하고, 카수가마이신 생산성은 기존의 80%수준까지 회복되었고, 계속적인 비드 유출로 인해 안정적인 조업이 불가능하였다.
희석 속도 변화에 의한 영향을 알아보기 위한 실험에서, 희석속도를 $0.50 h^{-1}$에서 $0.1h^{-1}$로 두 배 증가시켰을 때, 부피생산성의 증가가 관찰되었다. 그러나, 높은 생산성에도 불구하고, 세포가 고정화된 비드가 다량 유출되는 것이 관찰되었다. 한편, 희석속도를 $0.2h^{-1}$로 증가시켰을 때, 비드의 유출은 발생하지 않았으나 부피생산성은 물론 비 생산성의 감소가 관찰되었다. 높은 부피 생산성 및 기질 활용도, 안정적인 조업을 고려할 때, 이러한 결과는 $0.05h^{-1}$에서의 조업이 최적임을 보여주었다.
초기 비드 농도를 60g/L로 낮추어 수행한 연속실험에서, 과도한 세포 담지량이 관찰되었고, 이는 분리기에서의 분리능을 감소시켜 안정적인 조업을 불가능케 하였다. 비드가 유출되는 상황에서 비드 첨가에 의한 영향을 조사한 결과, 세포의 in-situ 고정화 효율은 낮았을 뿐만 아니라 카수가마이신 생산성의 현저한 감소가 관찰되었다.
