Staphylokinase (SAK), a polypeptide secreted by Staphylococcus aureus, is a plasminogen activator with a therapeutic potential in thrombosis diseases. SAK gene is cloned from Staphylococcus aureus NCTC 10003. Expression plasmid pSAK704 carrying a promoter and a signal sequence of subtilisin fused in frame with the sak open reading frame was constructed and introduced into Bacillus subtilis strain which is multiply deficient in exo-proteases. However, the amount of SAK secretion was marginal and there was a severe degradation in the process of purification. A protease inhibitor, PMSF prevented the proteoytic degradation of secreted SAK in the extracellular medium. Thus, it was suspected that residual protease activity is responsible for the degradation of gene products.
B. subtilis LB700 was constructed from B. subtilis WB600 by disruption of wprA gene which encodes a subtilisin-type cell-wall-associated protease, using a temperature-sensitive suicide vector, pDWPRA. The cultivation of B. subtilis LB700 carrying pSAK704 at 37°C for 20 h in LB medium resulted in a 4-fold increase (181mg/liter) in production of staphylokinase. In addition, the extracellular stability of mature SAK was ten-fold enhanced. These data implicate a significant role of the wprA gene product in degrading SAK, both during secretion and in the extracellular milieu.
Streptokinase (SK) secretion vector pSK704 was constructed and introduced into B. subtilis. B. subtilis LB700 carrying pSK704 produced $4x10^6$ IU/liter of SK in the cultivation at 37°C for 16h in the LB medium, which is a 2-fold increase compared with that of WB600. Western blot analysis showed SK fragments specifically digested by a WprA protease. In order to evaluate the significance of WprA in foreign protein production, disruption of wprA gene in different versions of mulfiple-protease-deficient B. subtilis strains. Inactivation of wprA in B. subtilis 168, DB104 and DB428 resulted in LB100, LB300 and LB500, respectively. SAK secretion in LB500 increased as LB700. However, SAK secretion in LB100 and LB300 was declined compared with 168 and DB104. Oversecretion of self-extracellular proteases was observed in wprA-disrupted B. subtilis. Actually, secretion of bacillolopeptidase F was promoted by 20% in wprAdisrupted strain. These data indicate that disruption of wprA gene promotes not only production of foreign proteins, but also secretion of self-extracellular protease. Therefore, wprA inactivation in lower versions of B. subtilis such as 168 or DB104 may cause the oversecretion of self-extracellular proteases and the decrease of the production yield of foreign proteins.
SAK was expressed into periplasm (15mg/liter) and extracellular media(5mg/liter)of E. coliusing ompA signal sequence. The expression library of random mutants was constructed of the screening of SAK with enhanced activity. Mutagenic polymerase chain reaction of SAK gene was carried out and the products was inserted the secretion vector, pSAKR. E. coli XL1-Blue was transformed with pSAKR library, subsequently spread on the plate, and overlaid with top agar containing skim milk-plasminogen. Out of a thousand and five hundreds colonies, 6 colonies showing enhanced clear zone around each colony were selected and their DNA sequences were determined. The chromogenic assay of crude extracts obtained from periplasm was performed. Among them, one with highest activity was selected and its specific activity was determined. As a result, the plasminogen activation activity of a SAK mutant (K35E, T53A, T90P, K96E, K1 09E) showed a 1.54-fold increase of that of wild-type SAK.
스타필로카나제 세균성 분비단백질로서, 인체 플라스미노겐의 활성화 작용을 하는 혈전용해제이다. 스타필로커나제의 유전자를 Staphylococcus aureus NCTC10033 에서 cloning하여 subtilisin promoter와 signal sequence 를 이용하여 stationary phase 에서 chemical inducer 없이 스타필로키나제를 분비시킬 수 있는 벡터 pSAK704 를 제작하였다. 고초균 DB428 과 WB600 균주에서는 stationary phase 에서 스타펄로키나제의 발현량이 예상과 달리 오히려 감소했고, 정제과정에서 심각한 분해가 있었다. 이러한 세포외 배지에서 스타필로커나제의 분해는 단백질가수분해효소 저해제인 PMSF 애 의해서 방지될 수 있었다. 따라서, 외래단백질인 스타펄로키나제의 분해가 고초균이 갖는 세포외 분비성 단백질 가수분해효소에 의한 것으로 판단되어, 온도민감성자살 벡터 pDWPRA 를 이용하여 고초균 WB600균주에서 세포벽에 연관되어 있는 단백질 가수분해효소의 유전자를 파괴시켜 LB700 균주를 제조하였다. LB700 균주에서 스타펄로키나제의 생산량은 LB 배지에서 37°C에서 20시간동안 배양한 결과, 181mg/liiter 로. WB600 균주에서 최대생산량보다 4배가 증가하였다. LB700 균주의 배지에서의 스타펄로커나제의 반감기는 10배가 증가하였다. 이로서 WprA 는 세포벽을 통과하는 분비과정뿐아니라, 세포외 배지에서도 단백질 가수분해에 매우 중요한 역할을 함을 밝혀냈다. subtilisin promoter와 signal sequence 를 가진 스트랩토키나제 발현벡터 pSK704 를 제작하여,고초균에서 발현시켰다. 스트랩토키나제의 생산량은 LB배지에서 37°C 에서 16시간동안 배양한 결과 $4\times10^6$ IU/liter로서 2 배가 증가하였다. Western blot analysis의 결과, WprA 작용에 의한 스트랩토키나제의 분해를 관찰할 수 있었다. 고초균에서 외래단백질생산에 대한 WprA의 중요도를 검증하기 위해, 파괴된 세포의분비 단백질가수분해 효소의 갯수가 각각 다른 고초균 168, DB104, D8428 에서 wpA 유전자를 파괴시켜, 고초균 LB100, LB300, LB500 을 제작하여 스타필로커나제를 발현시켰다. 그 결과, LB500에서는 LB700의 경우와 마찬가지로 생산량이 향상되았지만, LB100, LB300에서는 오히려 생산량이 감소하였다. 그리고, wpA 유전자 파괴에 의해서 고초균 자신의 세포외 단백질 가수분해 효소인 Bacillopeptidase F 의 발현량이 20% 가량 증가됨을 관찰하였다. 이로서, wpA 유전자파괴는 외래단백질 분비뿐 아니라, 자기자신의 단백질 가수분해 효소의 분비를 촉진하는 것을 밝혔다. 따라서, 세포외 단백질가수분해효소를 충분히 제거시키지 못한 균주에서는 wpA 유전자파괴가 세포외 단백질가수분해효소의 분비를 촉진시켜, 오히려 외래단백질의 생산량을 감소를 유발한다고 사료된다. 대장균에서 Outer membrane protein A (ompA)의 신호서열을 이용한 분비시스템으로 스타필로커나제 15mglliter 과 5mg/liter 주변세포질과 세포외로 발현시켰다. 이 시스템으로 스타필로키나제 무작위 돌연변이 발현 library를 제조하여 활성이 증진된 돌연변이를 screening 할 수 있는 체계를 구축하였다. 스타필로키나짜의 구조유전자만을 PCR 법을 이용하여 무작위돌연변이시켜, pSAKR 돌연변이 library 를 제조하여, 대장균 XL1-Blue 에 형질전환시켜서, 발현 library를 만들어서 Skim milk-plasminogen plate assay를 이용하여 1500개의 colony 들중에서 clear zone 의 영역이 확대된 colony 를 6개 선택하여, DNA 염기서열분석으로 단백질의 바뀐 아미노산을 확인하였다. Crude extract assay에서 역가가 가장 높은 돌연변이 단백질을 정제하여， specific activity를 결정하였다. 그 결과, 136개의 아미노산중 5 개가 바뀐 돌연변이 (K35E, T53A, T90P, K96E, K109E) 의 plasminogen activation rate가 wild type 에 비해 1.54 배가 증가하였다.
