I previously constructed a full set of SP6 promoter mutants with all possible single substitutions at position -17 to +5, and measured transcription activities of the variants individually in vivo and in vitro (Shin, 1997). Here, a method displaying any saturation mutagenesis data was developed. Resulting activity logos graphically display a quantitative hierarchy of all base pairs of SP6 promoter.
Although the comparison of in vivo and in vitro activities of various mutants gave some clues about their different functions according to the positions, it is insufficient to say what bases involve primarily in polymerase binding or post-bindingsteps including DNA melting. Therefore, we utilized mobility shift binding assay to determine bases involving in the interactions with SP6 RNA polymerase. When 58bp DNA fragment harboring SP6 promoter sequence was used as binding probe, various bound complexes were isolated in the absence of any NTPs, unexpectedly. The complexes differed in gel mobility, temperature dependence, and specific competitor sensitivity. These results indicate that these complexes,are an open complex and a closed complex. Initiation nucleotide, GTP, did not affect the formation of binary complexes and the conversion between a closed complex and an open complex at below 30°C. At 37°C, however, the stability of bound complexes was affected by the presence of GTP, suggesting that the conversion to tertiary complex would be important to maintain RNA polymerase-promoter bound complex at high temperature.
The total bound amounts were showed wide differences among promoter variants at 30°C. T-15C, T-I0G, and T-2G variants increased binding affinit and T-I0A, T-4G, and a substitution at positions from +1 to +5 had little effect on binding affinity with SP6 RNA polymerase. A substitution at positions -11 ,-9, -8, -7 and -5 cause serious reduction of binding affiniy, suggesting that these base pairs are essential to binding with SP6 RNA polymerase. Interestingly, a substitution at positions from -4 to -1 resulted in only mobility shifts of open complexes and had little effect on amounts of open complexes. When temperature was changed to 20°C, what interfere with the isomerization of binary complex were rather binding domain mutants, in particular base pairs at -7, -6, and -5, than initiation domain mutants. These results propose new roles of each of domains that have been suggested as a binding domain and a melting-initiation domain. Based on these results, we suggest that upstream binding energy is used in template melting and base pairs at -7, -6, and -5 involve in the transmission of binding energy to downstream region to facilitate opening of DNA.
A comparison of the sequences of phage RNA polymerases and their promoters suggested residues having potential to interact with base pair at -11, -10, -9, -8, and -7. Various mutants were introduced into suggested positions to determine amino acids that participate in specific promoter recognition in SP6 RNA polymerase. Changing the amino acid residue at position 744 in SP6 RNA polymerase resulted in an enzyme with altered specificities for base pair at position -7; R744I, R744F, R744Y, R744H, and R744K more efficiently utilized the C-7T variant than wild promoter and R744Q preferred C-7A variant. Substitution of 754 Lys to Arg caused altered specκkity for the base pair at -8. Some 754 mutants, K754T, K654S, and K754H, also showed reduced specificities to -9 variants as well as -8 variants. These results suggest that 744 Arg residue of SP6 RNA polymerase specifically recognize -7 base pair and 754 Lys residue involve in discrimination of base pairs at -8 and -9. On the other hand, mutant RNA polymerases with clearly altered specificity at -11 have not been shown. However, 746 Arg residue, which is correspond to 748 Asn of T7 RNA polymerase interacting with -10/-11 base pairs of T7 promoter, and 748 Cys residue are suggested to involve in interaction with base pairs at -11 and -10. Substitutions at 746 induced enzymes with broad specificities for -11 base pair and C748K enzyme exhibited increased activity on G-11T variant. It proposed that specific recognition of base pair at -11 would be a result of the collaboration 746 Arg and 748 Cys.
본 연구에서는 먼저 이전 연구에서 얻은 SP6 전사촉진제의 saturated mutation 데이터를 효과적으로 표현할 수 있는 그래픽 방법을 개발하였다. 이 방법은 전사 개시 과정의 에너지론에 근거하였으며,도시된 activity logo 는 SP6 전사촉진제 내 염기짱들의 기능적 중요도를 효과적으로 보여준다
SP6 전사촉진제 돌연변이체들의 in vivo 와 in vitro 전사효울의 비교는 각 염기쌍들의 역할을 추측할 수 있는 단서를 제공해 주지만,각 염기짱들이 중합효소와의 결합에 관여하는지 아니면 결합 이후의 단계에 관여하는지를 결정하기엔 부족한 면이 있다. 이에 본 연구에서는 SP6 RNA 중합효소와의 상호작용에 관여하는 염기쌍을 결정하기 위하여 gel mobility shift binding assay 를 수행하였다. SP6 전사촉진 제를 포함하는 58bp 의 DNA 조각을 binding probe로 사용하였을때, 여러가지 SP6 RNA 중합효소-전사촉진제 결합체를 분리할 수 있었다. 이 결합체들은 젤 상에서의 이동속도 및 온도에 대한 반응,specific competitor 에 대한 민감성 등에서 차이를 보였다. 이러한 결과는 이들 결합체들이 open complex 와 closed complex 임을 나타낸다. 전사개시 기질인 GTP 는 closed complex 에서 open complex 로의 전환에 영향을 미치지 않았다. 단,37℃에서는 GTP 의 유무가 RNA 중합효소-전사촉진제 결합체의 안정성에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 이것은 온도가 높은 환경에서는 tertiary complex 로의 전환이 SP6 RNA 중합효소와 전사촉진제 간의 결합을 유지하는데 중요하다는 것을 암시한다.
30℃ 에서 SP6 전사촉진제와 SP6 RNA 중합효소와의 결합은 전사촉진제 돌연변이채에 따라 큰 차이를 보였다. T-15C, T-IOG, T-2G 돌연변이체들은 RNA 중합효소와의 결합을 증가시켰T-IOA, T-4G 돌연변이 및 +1 에서 +5 까지의 돌연변이체들은 중합효소와의 결합에 거의 영향을 미치지 않았다. 반면 -11, -9, -8, -7, -5 위치에서의 염기 변화는 SP6 RNA 중합효소와의 결합에 심각한 영향을 미쳤다. 이것은 이 위치의 염기쌍들여 SP6 RNA 중합효소와의 결합에 중요하다는 것을 의미한다. 흥미롭게도 initiation domain 으로 알려진 -4 야서 -I 위치의 염기변화는 open complex 로의 전환에 거의 영향을 미치지 않았다. 온도를 20℃로 낮추었을 때 binary complex 의 isomerization 에 영향을 미친 것은 initiation domain 돌연변이들이 아니라 바로 binding domain 돌연변이들이었다. 특히 -7, -6, -5 위치의 염기변화는 20℃에서 open complex 로의 전환을 심각하게 저해하는 것으로 나타났다. 이러한 결과들은 그 동안 binding domain과 initiation domain 으로 나뉘어져 왔던 파아지 전사촉진제의 기능 연구가 재고되어야 함을 의미한다. 또한 이러한 결과는 upsπearn binding energy 가 DNA 주형의 melting 에 쓰이며 -7, -6, -5 염기쌍들이 downstream region 으로의 에너지 전달에 중요하다는 것을 암시한다.
본 연구에서는 또한 파아지 RNA 중합효소과 전사촉진제들의 서열을 비교하여 -11 , -10, -9, -8,-7 염기쌍을 인지할 것으로 예상되는 아미노산 잔기들을 결정하였다. SP6 RNA polymerase 에서 744 번 Arg 잔기를 다른 여러 아미노산으로 치환하였을 때 -7 염기짱에 대한 선호도에 변화를 보였다. R744I, R744F, R744Y, R744H, R744K 돌연변이체는 야생형 전사촉진제 보다 C-7T 전사촉진제 돌연변이체를 선호하였고, R744Q 는 C-7A 돌연변이체를 선호하는 경향을 가졌다. 754 번 Lys 을 Arg 으로 변화시켰을때 -8 염기쌍에 대한 specificity 변화를 유발하였다. 일부 754 돌연변이체들(K754T, K754S, K754H)은 -8 뿐만 아니라 -9 염기쌍에 대해서도 relaxed specificity 를 나타내었다. 이 결과는 SP6 RNA 중합효소의 744 Arg 이 -7 염기쌍을 인지하고 754 Lys 이 -8 및 -9 염기쌍을 인지한다는 것을 의미한다. 한편,- 11 염기쌍에 대해서는 눈에 띄게 변화된 specificity 를 나타내는 SP6 RNA 중합효소 돌연변이체를 얻을 수 없었다. 단 746 Arg 을 치환한 돌연변이체들이 -11 염기쌍에 대해 relaxed specificity 를 유발하였고 R746T 및 C748K 가 G-llT 전사촉진제에 대해 증가된 전사 효율을 나타내었다. 이러한 결과는 -11 염기쌍의 특이적 인지에 746 Arg 및 748 Cys 가 함께 관여할 가능성을 제시한다.
