It was investigated whether mouse SINEs (short interspersed elements)could influence the recombination frequency of a foreign DNA. Vectors harboring areporter gene in combinations of SINEs B1and/or B2, or a portion of L1NE-1 (longinterspersed element-1) were prepared, and tested in vitro by a colony assay using HC11 murine mammary epithelial cells, and in vivo by microinjection into fetilizedmouse eggs. In transfected HC11 cells, the number of colonies surviving G418 selection increased by 3.5 fold compared to control when the reporter was flanked by fused B1-B2 sequences. By applying pronuclear microinjection technique to themouse in-vivo system, the integration frequency of Lac Z reporter gene flanked bya fused B1/82 was examined. In the preimplantation stage, the SINE-flanked DNAshowed a 4-fold increased integration frequency of the reporter gene than thecontrol DNA (63% vs 16%). Moreover, the level of - galactosidase expression, estimated from the X-Gal staining intensity in transgenic embryos, was greatly higher in SINE-carrying DNA. Similar results were obtained from microinjection study; in 11.5 dpc fetuses, the transgene positives in control and SINE-flanked vectors were 16 % and 53 %, respectively. Individual B1- and B2-harboring vectorsshowed equivalent activities with each other, as determined by the colony assay(2.8 versus 3.2 fold compared to control). The contribution of homologous recombination to the SINE-mediated increase in integration frequency was determined through a peR-based strategy; in more than half of embryos transgenes underwent homologous recombinations involving b1 sequences. These results demonstrate that the SINE sequences can increase the integration rate of foreign DNA and that such an increase is most likely due to the enhancement of homologous recombination. In conclusion, the SINE sequences can serve a very useful tool in improving the efficiency of current transgenic animal technology.
생쥐에 존재하는 반혹 서열인 SINE (Short interspersed elements) 서열이 외래유전자의 교차 빈도에 영향을 줄 수 있는지의 여부를 조사하였다. 먼저 생쥐유래 SINE 서열인 BI및 B2서열과 LINE-I (Long interspersed elements-I) 서열의 일부를 여러 가지 조합으로 표지 유전자에 결합시킨 백터를 제조한 후, 생쥐 유래 유선 상피세포주인 HCll 세포로 유전자도입올 유도, colony assay 를수행하였다. 항생제 G418 의 존재하에서 살아남은 콜로니의 수를 비교한 결과, 대조군에 비해 BI-B2 융합서열이 포함된 실험군이 3.5 배 정도 높은 콜로니수를 나타냈다. 생쥐 수정란의 전핵에 이들 두 가지 벡터를 각각 미세주입 하여 배반포 단계에서 베타-갈락토시데아제 분석을 수행하였다. 비교군이 16%정도의 배반포에서 X-gal 침전을 보인 반면, SINE서열이 포함된 실험군의 경우 63%의 배반포에서 침전을 확인 할 수 있었다. 또한, X-gal 침전을 보인 배아들에서 베타-갈락토시데아제의 발현 수준은 SINE 융합서열이 포함된 벡터에서 훨씬 높게 나타났다. 융합 SINE 서열을 구성하는 각각의 Bl 및 B2 서열을 분리하여 리포터 유전자에 포함한 후 colony assay 실험을 통해 비교군과의 유전자 삽입 효율을 조사한 결과, 비교군에 비해 각각 2.8 배, 3.2 배 정도 높은 콜로니 수를 얻었으며, 두 SINE 서열은 서로 유사한 삽입 능력을 가짐을 알 수 있었다. SINE 매개에 의한 삽입 효율증가에 있어 상동성 교차가 관여하는지 여부를 알아보기 위해 Hord-PCR 을 수행하였다. 결과, 절반 이상의 미세 주입된 배아에서 외래 유전자가 BI 서열이 관여된 상동성 교차가 일어남을 확인할 수 있었다. 이 실험의 결과로 SINE 서열이 외래 유전자의 삽입률을 증가 시킬 수 있고, 이러한 삽입 효율의 증가가 SINE 서열간의 상동성 교차에의해 유발됨을 추측 할 수 있었다. 결론적으로 SINE 서열은 현재의 형질전환동물 생산 기술의 효율을 높이는데 있어 매우 유용한 수단으로 기여할 것으로 사료된다.
