Enhancement of the production of recombinant EPO(Erythropoietin) was studied by using Chinese hamster ovary cell. Butyrate, which is known to alter the difffrentiation of mammalian cells were used to increase the recombinant protein. However, when butyrate was treated in rapidly growing cells, thedeath of the cells occurred. Intra-nucleosomal DNA fragmentation showed that the death was due to apoptosis. The induction of apoptotic death of thecells could be partially blocked by treatment with the well-known antioxidant, N-acetycysteine(NAC). Strikingly, the NAC treatment enhanced the production of recombinant EPO two-fdld, compared with that of the culture without NAC supplementation. These results show that butrate supplemented with NAC not only inhibited apoptosis, but also exerted a synergistic effect on the production of recombinant EfO. Considering its role as antioxidant, NAC was thought to scavenge Reactive oxygen species(ROS) that might act as signal to apoptosis. However, mechanism of production of enhancing effect is remained to be investigated.
In order to investigate the mechanism for enhancement of production by NAC, effect of thiol reducing agents that have similar effect to NAC, was studied. Mild reducing agents, Mercaptoethansulfonic acid (MESNA), Thiolactic acid (TLA), Thioglycolate (TG) were shown to block apoptosis and also increase the production of EPO. In order to find out whether the efffct was general on CHO cells or not, other transformant cells (EC-2 2C5, EC-2 1H9) that produce different amount of EPO were tested. The production enhancing effect was approximately similar in all the cells. The secretion kinetic study using pulse-chase method revealed that all four thiol reducing agents significantly increased the secretion rate of EPO. It was deduced that the thiol reducing agents increased the secretion rate by altering environmental condition of endoplamic reticulum from the oxidative state to the slightly reduced state and facilitate the folding of the proteins. The moehology of the cells was observed to be altered to irregular shape in presence of thiol reducing agent.
EPO molecule has a complex oligosaccharide structure that plays an important role in biological activity in viro. To figure out whether thiol reducing agent influence on the glycosylation or not, structural analysis of oligosaccharide was carried out. Cells were cultured in the medium supplemented with 20mM of NAC and then the culture supematant was withdrawn for purification of EPO. EPO was purified through the procedures employing heparin-sepharose affinity column, anion-exchange (MonoQ) column and gel permeation chromatography (Sephadex G-75) column. The purified EPO was treated with N-glycosidase F, for the isolation of oligosaccharide and the isolated oligosaccharides were labeled with fluorescent dye, 2-arninobenzarnide. Labeled oligosaccharide was analyzed with anion-exchange chromatography (MonoQ) and normal-phase chromatography (amide column, Glycosep-N) for the assignment of GU(glucose unit) value. Through the assignment of molecular mass using MALDI-TOF mass spectrometry, final structures of the oligosaccharide were analyzed. As the result, the relative amount of sialylated oligosaccharide in NAC-treated EPO was lower than in EPO obtained from the sample without NAC treatment. This implies that the sialyltransferase activity may not fully support the increased secretion rate of EPO in NAC-treated cells.
당단백질인 에리스로포에틴(EPO)을 생산하는 재조합 CH0(중국 햄스터 난소) 세포인 EC-1 세포 이용하여 EPO의 생산성을 증가 시키는 배양실험을 하였다. 먼저 생산성 증진을 위한 전략으로 부티르산을 첨가하는 실험을 하였다. 부티르산은 동물세포의 분화를 억제하는 화합물로 세포에 처리했을 때 재조합 단백질의 생산을 증가 시킨다. 그러나 세포가 활발히 성장하는 시기에 처리했을 때 세포의 사멸이 초래되었다. 전기 영동상에서 분석한 바에 의하면 부티르산을 처리했을 때 세포의 DNA의 절편이 관찰되고 사멸에 따라 절편화된 DNA가 증가하는 것으로 세포의 사멸이 아포프토시스 (apoptosis)에 의한 사멸인 것을 밝혀내었다. 이러한 부티르산에 의해 유도되는 사멸을 억제하기 위해 황환원제이며 아포프토시스 억제물질로 알려진 NAC(N-acetylycysteine)을 이용하여 세포의 사멸을 부분적으로 억제하는데 성공하였다. NAC을 부티르산과 동시에 처리해주었을 때 EPO의 생산이 부티르산만 처리했을 때에 비해 2배가량 중가하는 상승효과를 가져옴을 발견했고 이러한 NAC의 효과는 NAC 자체만 처리해 주었을 때도 나타남을 알았다. NAC의 효과는 NAC이 갖는 항산화제적 특성을 고려했을 때 아포프토시스 유발신호로 작용하는 활성산소를 제거하여 아포프토시스를부분적으로 억제하는 것으로 보여지나 생산성을 증가시키는 정확한 이유는 알 수가 없었다.
NAC의 생산성 증가 기전을 밝혀내기 위한 접근으로 먼저 NAC와 유사한 물질을 검색하였다. NAC와 같이 약한 산화제로서 황(thiol)기를 갖는 mercapto-ethansulfenic acid (MESNA), thiolactic acid (TLA), thioglycolate (TG)가 세포의 사멸을 억제하는 동시에 생산성도 증가 시킴을 발견하였다. 이러한 황환원제의 효과가 EC-1외 다른 세포에도 작용하는지를 실험해본 결과 EPO를 생산하는 다른 CHO 세포 (EC-2 2C5, EC-2 IH9)에도 유사한 효과가 나타남을 발견하였다. Pulse-chasing 법을 통해 황환원제를 처리했을 때 EPO의 분비속도를 관찰해본 결과 황환원제를 넣었을 매 분비속도가 더욱 빨랐으며 4가지 황환원제 모두가 분비증진 효과를 나타내었다. 황환원제는 세포내에 유입되어 산화적인 소포체내 조건을 약하게 환원시켜줌으로 단백질의 접힘이 잘 일어나게 하고 결국 분비를 원활하게 일어나도록 해준다는것으로 추정할 수 있었다. 또한 세포에 20mM의 NAC을 처리해 주었을 때 세포의 모양이 변하며 세포질 내에 맡은 소포(액포)가 생성되는 것을 미루어 보았을 때 단백질의 활발한 분비에 기인함을 추정할 수 있었다.
EPO 분자는 복잡한 당쇄구조를 갖으며 이는 의약품으로서 생물학적 활성에 중요한 역할을 한다. 황환원제가 EPO의 생산을 증진시키지만 동시에 EPO 당쇄 합성에 영향을 주는지를 알아보기 위해 황환원제인 NAC을 20mM 첨가해준 배지에서 세포를 배양하고 이로부터 EPO를 분리, 정제하였다. 배양액은 헤파린 칼럼, 음이온교환 칼럼 (MonoQ), GPC 칼럼(Sephadex G-75)을 거쳐서 최종적으로 순수 분리된 EPO를 얻었다. 순수분리된 EPO로부터 당쇄절단 효소인 N-Glycosidase F를 이용하여 당쇄를 잘라낸 후 이를 형광물질로 표지시켰다. 형광물질로 표지된 당쇄는 음이온교환칼럼 (MonoQ)로 분리했으며 여기서 얻은 분획은 다시 아미드칼럼 (Glycosep-N)으로 분석하여 각 당쇄의 GU (glucose unit, 당단위)값을 얻었다. GU값은 당쇄구조를 예측하는 중요한 정보가 되며 아미드 칼럼으로 분석했던 동일한 분획을 MALDI-TOF 질량분석기를 이용하여 질량을 측정함으로 최종적인 구조를 결정할 수 있었다. 이와 같은 분석을 통하여 NAC가 처리된 배양액에서 분리된 EPO는 정상의 경우와 비교했을 때에 전반적인 구조는유사하나 말단의 시알산(sialic acid)의 양이 적었다. 이러한 사실은 세포내 시알산 전달효소의 활성이 NAC로 인한 증가된 분비속도를 충분히 됫받침을 해주고 있지 못하는 것으로 판단된다.
