Four different recombinant Chinese hamster ovary(rCHO) cell lines expressing antibody with various gene copy numbers of chimeric antibody against S surface antigen of hepatitis B virus(HBV) were subjected to hyperosmotic stress resulting from NaCl addition. Each cell line(CSl3-0.02*, CSl3-0.08*, CSl3-0.32*, CSl3-1.00*) maintained in the presence of different methotrexate(MTX) concentrations (0.02, 0.08, 0.32, and 1.00 μM) was cultivated in batch modes at various osmolalities ranging from 302 to 620 mOsn/kg to investigate whether cellular responses to hyperosmotic stress vary depending on gene dosages. Specific growth rate and maximum viable cell concentration were decreased at hyperosrnolality in all cell lines. On the other hand, when medium osmolality was elevated up to 469 and 542 mOsn/kg, specific antibody productivity ($q_{Ab}$) whose increase was limited during gene amplification process was increased by 86-172% and 282-566% in all cell lines, respectively. Antibody mRNA content per cell determined by Northern blot analysis is was shown to be increased with medium osmolality in all cell lines regardless of antibody gene dosages. This increase was not only attributed to the increase in mRNA content per total RNA but also to the increase in total RNA content per cell. Hyperosmotic stress induced growth arrest in Gl phase which is known to be beneficial to protein production in recombinant animal cell cultures. Taken together, hyperosmotic stress would be used in commercial production of foreign protein from rCHO cells along with gene amplincation Precess.
When 3 recombinant Chinese hamster ovary(rCHO) cell lines, CHO/dhfrB22-4, CSl3-1.00* and CSl3-0.02*, were cultivated in hyperosmolar media resulting from NaCl addition, their specifc foreign protein productivity increased with medium osmolality However, due to a simultaneous suppression of cell growth at elevated osmolality, no enhancement in the maximum fareign protein titer was made in batch cultures. To test the feasibility of using glycine betaine, known as a strong osmoprotective compound, for improved foreign protein production in hyperosmotic rCHO cell cultures, hyperosmotic batch cultures were cairied out in the presence of 15 mM glycine betaine. Glycine betaine was found to have a strong osmoprotective effect on all 3 rCHO cell lines. Inclusion of 15 mM glycine betaine in hyperosmolar medium enabled rCHO cell lines to grow at 557-573 mOsm/kg where they could not grow in the absence of glycine betaine. However, effect of glycine betaine inclusion in hyperosmolar medium on foreign protein production differed among rCHO cell lines. CHO/dhfr-B22-4 cells retained enhanced specific human thrombopoietin(hTPO) productivity in the presence of glycine betaine, and thereby, the maximum hTPO titer obtained at 573 mOsm/kg was increased by 72% over that obtained in the control culture with physiological osmolality(292 mOsm/kg). On the other hand, enhanced specific antibody productivity of CSl3-1.00* and CSl3-0.02* at elevated osmolality was decreased significantly in the presence of glycine betaine. As a result, the maximum antibody titer at 557 mOsm/kg was similar to that obtained in the control culture with physiological osmolality. The mRNA contents per cell determined by Northern blot hybridization correlate with q in all three rCHO cell lines, indicating that transcriptional regulation is responsible in part for q enhancement at hyperosmolality in the absence as well as the presence of glycine betaine. Taken together, efficacy of the simultaneous use of hyperosmotic pressure and glycine betaine as a means to improve foreign protein production was variable among different rCHO cell lines.
Suspension fed-batch culture of TPO-producing 2-3-1 cells using medium concentrate and glycine betaine showed improved productivity compared with batch and typical fed-batch cultures. Glycine betaine protected cells from hyperosmotic shock resulting from the addition of medium concentrate, which probably led to enhanced maximum TPO concentration. However, TPO concentration was decreased in the later part of the culture with the decline of viable cell concentration and viability, which should be overcome for higher productivity.
B형 간염 바이러스의 S 표면 항원에 대한 키메라 항체를 생산하는서로다른 4종류의 재조합 Chinese hamster ovary(CHO) 세포를 NaCl이 첨가된 고삼투압 환경에 노출시켰다. 각기 다른 농도의(0.02, 0.08, 0.32, 1.00 μM) methotrexate(MTX) 존재하에서 유지된 각 세포주들을(CSl3-0.02*, CSl3-0.08*, CSl3-0.32*, CSl3-1.00*) 302-620 mOsm/kg 범위의 고삼투압 환경에서 회분 배양하여 고삼투압에 대한 세포의 반응이 항체 유전자의 copy 수에 따라 달라지는가를 조사하였다. 비성장속도와 생존세포의 최고농도는 모든 세포주들에서 감소하였다. 반면, 배지의 삼투압이 469와 542 mOsm/kg까지 증가되었을 때, 유전자 증폭과정에서 그 증가가 제한되었던 비항체 생산속도가 모든 세포주들에 대해서 각각 86-172% 및 282-566% 만큼 증가하였다. Northern 분석에 의해 결정된 단위세포당 존재하는 항체 mRNA의 함량은 모든 세포주들에서 증폭정도에 관계없이 배지의 삼투압이 증가함에 따라 공히 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 증가는 전 RNA 당 항체 mRNA 비율의 증가뿐만 아니라 단위 세포당 전 RNA 양의 증가에도 기인하는 것임을 알 수 있었다. 고삼투압은 세포주기를 재조합 단백질의 생산성이 높다고 알려져 있는 G1 phase에 머물게 하였다. 이러한 점들을 고려해 볼 때, 고삼투압은 재조합 CHO 세포로부터 외래단백질의 상업적인 생산에 유전자 증폭과 함께 사용될 수 있겠다.
세 종류의 재조합 CHO 세포주들, CHO/dhfr-B22-4, CSl3-1.00*, CS13-0.02*,을 NaCl이 첨가된 고삼투압 배지에서 배양하였을 때, 비항체 생산속도는 배지의 삼투압의 증가와 함께 증가하였다. 하지만, 고삼투압 환경하에서 저해된 세포의 성장 때문에 회분 배양시 생산되는 외래단백질의 농도에 대해서는 증가가 관찰되지 않았다. 강력한 삼투압 보호제로 알려져 있는 glycine betaine의 고삼투압 배양에서의 이용 가능성을 평가하기 위하여, 15 mM의 glycine betaine의 존재하에 고삼투압 회분배양을 실시하였다. 세 종류의 세포주들 모두에 대해 고삼투압 환경하에서 glycine betaine의 강력한 보호효과가 관찰되었다. 15 mM의 glycine betaine의 첨가로 인해 세포가 성장할 수 없었던 557-573 mOsm/kg의 고삼투압 배지에서도 세포가 성장할 수 있었다. 하지만, glycine betaine의 첨가가 외래 단백질 생산에 미치는 영향은 세포주들에 따라 다른 것으로 나타났다. CHO/dhfr-B22-4 세포는 glycine betaine의 존재하에서도 증가된 비인간트롬보포이에틴 생산성($q_{hTPO}$)을 유지함으로써 573 mOsm/kg환경에서 생산된 hTPO의 농도가 대조군 배양(292 mOsm/kg)에서 얻어진 값에 비해 72% 높은 값을 나타내었다. 이에 반해, CSl3-1.00* 및 CSl3-0.02* 세포주들에 대해서는, 고삼투압에 의해 증가된 비항체 생산 속도가 glycine betaine 존재하에서 크게 감소하였다. 그 결과, 557 mOsm/kg에서 얻어진 항체의 농도는 대조군 배양에서 얻어진 값과 비슷하였다. Northern 분석을 통해 결정된 단위 세포당 외래 단백질의 mRNA 함량은 모든 세포주들에 대해 비생산속도와 관련이 있음을 보여주었다. 이는 glycine betaine이 첨가되었거나 그렇지 않은 고삼투압 환경에서 비생산속도의 변화에 전사단계에서의 조절이 관여되어 있음을 말해준다. 이와 같이, 외래 단백질의 생산성 향상을 위해 고삼투압과 glycine betaine을 함께 사용할 경우의 효율성은 재조합 세포주들에 따라 다름을 알 수 있었다.
TPO를 생산하는 2-3-1 세포주를 배지 농축분과 glycine betaine을 사용한 현탁 유가배양법으로 배양하였을 때, 회분배양과 전형적인 유가배양에 비해 증가된 생산성을 얻을 수 있었다. 이는 glycine betaine이 배지 농축분의 첨가에 의한 고삼투압으로부터 세포를 보호함으로써 TPO 농도를 증가시킨 것으로 생각된다. 하지만 배양 말기에 세포의 생존률이 저하됨에 따라 TPO 농도 역시 함께 감소하는 것이 관찰되었는데, 이는 보다 높은 생산성을 위해 해결되어야 할것이다.
