(Part Ⅰ) We designed and expressed a single-chain(sc) DR51 molecule capable of forming a stable complex with antigenic peptide. sc DR51 was constructed by connecting C-terminus of βl domain to N-terminus αl domain using the flexible peptide linker (GGGGSIQGRISGGGGS, 16 amino acids). The peptide-binding preference of sc DR5l was determined to be similar to that of the authentic one, which requires a bulky hydrophobic residue at position-1 (P1) as a primary anchor. For the modulation of the peptide-binding affinity, we modified the binding pocket 1 of sc DR51 by site-directed mutagenesis. The relative binding affinity of engineered sc DR51 for several P1 -substituted peptides was measured by competition assay using fluorescence labeled peptide. sc DR51 molecule showed high affnity to self-peptide from myelin basic protein(MBP), 87-98 with Phe at P1 residue(F9OF). While the reduction of pocket 1 volume(βG86V) made the affinity of F9OF diminished, it rather increased the affinity of Ala-substituted peptide at P1 residue(F9OA). Through more extensive engineering in peptidebinding groove of sc DR5l molecule, it is expected that we can construct sc DR5l variants with various peptide ligand motif. High affinity binding peptide was also covalently linked to engineered sc DR5l molecule (peptide-linked single-chain DR51, plsc DR5l). Gel fltration illustrated that the structural compactness of our engineered sc DR5l molecule was promoted via peptide-binding as adistinct conformational change from an open to a compact form upon binding peptide in authentic class Ⅱ major histocompatibility complex(MHC) molecules. It was detected that peptide-binding increased the affinity of independent α2 chain but not β2 chain to sc DR51 molecule. More interestingly, adding independent α2 chain increased the in vitro folding rate of engineered sc DR51 molecule in presence of binding peptide, but it had little influence on that in absence of binding peptide. Adding independent β2 chain had not a significant effect on the folding rate with or without binding peptide. These results support that peptidebinding in sc DR5l molecule can induce a conformational change of the domaininteface between at and α2 domains.
(Part Ⅱ) Through a conformation search by a simulation calculation, the relationships between the amino acid sequences and the conformations of the third cornplementarity determining region of the antibody heavy chain(CDR-H3) were investigated to characterize the large conformational varieties of antibodies. Here, we focused on the structural role of the first CDR-H3 residue, and we selected two antibodies, 28B4 and PLG, whose CDR-H3 ronformations are significantly different, having Trp and Gly at the first position, respectively. Multicanonical molecular dynamics simulations, with the advantage of enhanced sampling efficiency, were performed for the CDR-H3 fragments of 28B4 and PLG, and a modified CDR-H3 model of 28B4, where the frst Trp residue was substituted with Gly. When the first CDR-H3 residue is Trp, almost all of the observed CDR-H3 loops were bent at the first residue. In contrast, when the first residue is Gly, large varieties of loop conformations were observed. The structural role of this Gly residue is discussed from the perspective of the other antibody structures in the database. When the surrounding residues were included in the calculations, CDR-H3 loop structures similar to those in the crystal structures were reproduced as the major conformations for both the 28B4 and PLG antibodies.
(Part Ⅰ) 주조직적합체는 외래 펩타이드를 T 세포의 수용체에 표현함으로 T 세포가 면역반응을 제어하도록 유도한다. 클래스 Ⅱ 주조직적합체의 경우 두 사슬로 이루어진 당단백질로 분자량의 크기와 두 사슬의 복잡한 구조가 생화학적인 연구에 걸림돌이 되어왔다. 본 연구에서는 단일사슬화된 클래스 Ⅱ 주조직적합체(sc DR5l) 분자를 설계하고 생산하였다. sc DR51 분자는 원조 sc DR51 분자와 같이 Pl 위치에 Phe를 가지는 펩타이드에 강한 결합력을 가졌다. 펩타이드 결합력의 경향성을 변화시키기 위해 sc DR5l 분자의 Pl 결합부위(pocket 1)를 단백질공학기법을 이용하여 변화시켰다. Pl 결합부위의 공간을 줄인 돌연변이의 경우 Pl 위치에 작은 잔기를 가지는 펩타이드(F9OA)의 결합력이 증진되었고 반대로 Pl 위치에 큰 잔기를 가지는 펩타이드(F9OF)의 결합력은 감소되었다. Pl 결합부위의 돌연변이 유도를 통하여 펩타이드 결합 경향성을 변화가 성공적으로 이루어졌다. 또한 sc DR5l 분자의 N 말단에 결합 펩타이드를 단백질 공학기법을 이용하여 연결한 분자(plsc DR51)를 생산하였다. 이미 원조 DR 분자에서 알려진 바와 같이 펩타이드 결합이 sc DR5l 분자를 밀집된 구조를 유도하는 것을 크로마토그래피를 이용하여 확인되었다. 그리고 독립적으로 발현된 α2 부위가 펩타이드 결합에 의해 sc DR5l 분자와의 결합력이 변화됨을 학인하였다. 또한 독립적으로 발현된 a2 부위는 sc DR51 분자에서 in vitro folding 유도를 촉진하는 것으로 나타나다. 반면 β2부위는 펩타이드 결합에 의해 sc DR51 분자의 결합력과 in vitro folding에서 변화를 보이지않았다. 이러한 결과들은 sc DR5l 분자에서 펩타이드 결합이 α1과 α2 부위사이의 표면에서의 구조적 변화를 유도한다는 사실을 시사한다.
(Part Ⅱ) 항체는 6개의 CDR부위의 다양성을 통하여 항원들을 인신한다. 이중 CDR-H3는 아미노산 배열의 다양성과 잔기수의 변화가 가장 큰 것으로 나타난다. CDR-H3의 아미노산 배열과 구조적 관계를 규명하기 위해 동역학적 모사실험물 이용하였다. 특히 CDR-H3 중 첫번째 아미노산이 전체 loop 구조에 미치는 영향에 초점을 맞추었다. 이미 3차원 구조가 알려진 두 항체, 28B4와 PLG는 CDR-H3의 첫번째 아미노산을 제외하고는 아미노산 서열이 유사하지만 구조의 차이는 크다. 강력한 구조 샘플링 방법인 multicanonical molecuardynamics 기법을 28B4, PLG와 28B4의 첫번째 CDR-H3 아미노산 치환체에 사용하였다. CDR-H3의 첫번째 아미노산이 Trp인 경우 앞쪽으로 굽은 한가지의 구조들만이 나타났다. 반면 첫번째 아미노산이 Gly인 경우 다양한 구조들이 나타났다. 실제로 구조가 알려진 항체들에서 첫번째 아미노산이 Gly인 경우와 그렇지 않은 경우 계산에 의해 나타난 결과와 유사하다는 것을 구조 데이터베이스 검색결과 나타났다. CDR-H3의 첫번째 아미노산이 Gly인 빈도가항체의 아미노산 배열 데이터베이스에서 높게 나타났는데 이는 Gly 잔기를 통해 CDR-H3의 구조 다양성을 증진시킬 것으로 추정된다. 그리고 주위 환경을 이루는 잔기를 포함한 경우 단백질결정구조와 같은 한가지 구조만이 계산되었다. 이러한 동역학적인 계산을 통한 CDR-H3의 구조계산이 항체의 구조 모델링에 응용될 것으로 기대된다.
