D-Amino acids are often "unnatural amino acids" because they are not commonly used as L-amino acids, and have attained a wide variety of commercia1 applications as ingredients in a food, feed, pharmaceutical and optically active intermediates. In recent years, optically pure D-amino acids have been attracted attention in pharmaceutical field and research scientist as intermediates for the preparation of antibiotics, peptide hormones, pyrethroids and other chiral drugs.
We Previously investigated the efficient expression of D-hydantoinase with its native promoter that was originated from B. stearothermophilus SD1. We successfully constructed the constitutive expression system using the promoter originated from Bacillus stearothemophilus SD1, and applied to efficient expression of active soluble N-carbamoylase in the recombinant E. coli. The expression level of N-carbamoylase in the crude extract of recombinant E. coli was approximately 16% of total proteins. For the numerical analysis and prediction of reaction, we determined the kinetic parameter of two enzymes at different pH value. The rate of racemization at pH 8.0 is 6.6 times much higher than the rate at pH 7.0. These results implied that the lower racemization rate of p-HPH at neutral pH condition may be one of the limiting factors in the D-amino acids production. The activity of N-carbamoylase at pH 8.0 was 25times more sensitive than pH 7.0. N-carbamoylase inhibition by ammonia was investigated to be a non-competitive inhibition.
In the development of enzymatic process, low solubility of the substrate, p-HPH has been one of the serious problems. We performed the reaction in the heterogeneous reaction system. The mathematical models are valid for the prediction of heterogeneous reaction system using separately expressed whole cell containing D-hydantoinase and N-carbamoylase as biocatalysts. The N-carbamoylase inhibition by ammonia was considered as a serious barrier for the production of D-amino acid at alkaline pH. The optimal reaction temperature was deternlined at 45℃, and optimal reaction pH was determined at pH 7.0 in this work. Rate of racemization might be one of the critical factors for the production of D-HPG and the sufficient solubillity of p-HPH may improve the process for the production of D-amino acids.
Co-expression system needs only a single cultivation step for enzyme production, and transport barrier of intermediate posed by cell membranes can be minimized,because sequential reaction takes place inside the same cells. We peformed theexperimental investigation and numerical analysis of co-expressed whole cell reaction.Consequently, the mathematicai models are valid for the prediction of heterogeneousreaction system using co-expressed whole cell containing both of D-hydantoinase and N-carbarnoylase as biocatalysts. The accumulation of intermediate in the aqueous solution was significantly reduced in the co-expressed system compared withseparately expressed system. Moreover, the amounts of enzyme loading wasreduced to obtain the same love of product yield. In the case of co-expressed wholecell reaction, the racemization rate and solubility were also signifcant factors for theimprovement of productivity of process.
We can suggest that the improvement of racemization rate by using racemase er use of organic solvent for the increment of substrate solubility at neutral pH is the usefulway for the improvement of D-amino acid process. Changes of N-carbamoylase properiies to remove of ammonia inhibition is the one of the alternative way to improve the process in the alkaline pH.
광학적으로 순수한 D-amino acids를 생산하기 위한 공정은 현재 여러가지가 존재하지만 hydantoin 유도체로부터 D-amino aicds를 생산하는 방법은 기질과 최종산물의 유동적 반응으로써 최근 각광받고있는 공정이다. decarbamoylation을 위해 사용되어지는 두번째 단계에서 고농도의 질산염을 사용하는 chemico-enzymatic 공정의 경우 발생되어지는 다량의 폐수로 인하여 공정의 문제점이 제기 되어지고 있으며 또한 발열반응으로인한 전체 공정의 수율저하가 공정의 효율성을 저해하는 요소로 지적되어지고 있다. 이와 같은 단점을 극복할 수 있는 방법중에 가장 이상적인 것은 두 단계를 모두 효소를 이용하는 완전 효소공정이라 할 수 있다. 본 연구에서는 이와같은 완전 효소공정의 개발을 위하여 사용되어지는 효소원을 대량생산할 수 있는 효율적인 발현시스템을 구축하고 이를 이용하여 전체 공정에 영향을 미치는 인자들의 분석과 예측을 위하여 공정을 수학적으로 모사하고 이를 통하여 예측함으로써 공정의 생산성 향상을 위한 방법을 개발하는데 목적이 있다.
산업적으로 유용한 두개의 효소원을 효율적으로 생산하기 위한 발현시스템의 개발을 위하여 Bacillus로부터 유래한 promoter부분을 분리하고 이를 이용하여 외부 단백질 발현을 살펴보았을 때, 각각의 외부단백질의 발현은 효율적으로 일어난다는 것을 알 수 있었으며 이를 이용하여 N-carbamoylase의 대장균내에서의 constitutive expression을 시도하였다. 결과적으로 발현정도는 전체 단백질의 약 15-20%의 효율적인 발현을 관찰할 수 있었다. 이런 효과적인 발현시스템은 N-carbamoyiase외에 산업적으로 유용한 다른 효소의 발현에도 유용한 시스템이라할 수 있으며, 본 연구를 통하여 효과적인 constitutive expression 시스템을 구축할 수 있었다.
서로 각기 발현되어진 두개의 대장균을 이용한 반응의 속도론적 분석과 모델링을 위하여 온도와 pH에서의 각 인자의 영향성을 고려하였다. 45℃이상에서의 기질의 변성과 N-carbamoylase의 낮은 열안정으로 인하여 전체 공정에서의 반응온도는 45℃로 결정하였다. 두 개의 효소원인 D-hydantoinase와 N-carbamoylase는 각기 상이한 pH에 대한 최적값이 존재하며 전체 공정의 최적화를 위하여 pH 7.0, pH 7.5, pH 8.0에서의 각 인자들의 영향을 살펴보았다. 결과로써 기질의 tautomerism에 의한 spontaneous racemization 속도가 pH 7.0 에서 pH 8.0에서 속도의 약 15.2 %에 해당하는 것을 알 수 있었으며 이런 속도의 저하는 pH 8.0에서의 D-hydantoinase에 의한 p-HPH의 분해속도를 현저히 감소시키게 되는 것을 알수 있었다. 또한 최종 산물인 D-HPG와 함께 생산되는 ammonia의 농도가 pH 8.0에서 N-carbamoylase의 활성을 non-competitive inhibition한다는 사실과 그 저해상수를 구함으로써 N-carbamoylase의 반응성을 각 pH에서 이해 할 수 있었다. 이외의 모델링에 필요한 인자들을 pH에 의해 변화하는 것은 각 실험을 통하여 결정하였으며 이외에 다양한 방법으로 인자를 예측할 수 있었다.
이와같은 과정을 통하여 구하여진 인자들을 이용하여 각기 발현된 recombinant cell을 이용하여 D-amino acid를 생산하는 공정을 수학적으로 모사하고 실험적인 반응의 결과를 분석하였다. 각기 발현된 cell을 biocatalyst로 사용하는 본 연구는 낮은 기질의 용해도로 인하여 고농도의 기질 전환을 위하여 heterogeneous reaction의 상태로 진행하였으며 두 효소를 이용하여 전환을 시도하였다. 결과로써 pH 7.0의 중성조건에서의 반응에서는 D-hydnatoinase의 기질로써 사용되어지는 D-p-HPH의 racemization rate 감소로 인한 전체 최종 산물의 생산 속도가 심각하게 저해 받는 결과를 관찰할 수 있었으며, 전체 반응을 모사한 모델링은 반응자체를 잘 설명할 수 있는 valid model임을 알 수 있었다. 또한 pH 8.0에서의 반응은 N-carbamoylase의 생성 ammonia에 의해 일정 농도 이상의 산물 생성후에 최종 산물 생성 속도에 심각한 감소를 초래하는 것을 알 수 있었다. 이와 같은 결과를 바탕으로 각 pH 조건에서 효소의 비율을 달리하여 반응을 분석한 결과 효소원의 활성에 영향을 미치는 alkaline pH에서의 반응은 바람직하지 못하며 pH 7.0에서의 반응이 최적임을 알 수 있었으며, 최적 비율은 1:1.4 이상임을 알 수 있었다. 효소의 양을 증가시켜 반응을 분석한 결과 D-hydantoinase 6400 U과 N-carbamoylase 8960 U가 80%의 conversion yield를 얻기위한 최적의 효소량이라는 사실을 결정할 수 있었다. 또한 sensitivity analysis를 이용한 각 인자의 영향성을 고려한 결과 전체 반응에 큰 영향을 미치는 것은 효소원 자체의 기질에 대한affinity보다는 racemization rate의 향상과 solubility임을 알 수 있었다.
두개의 효소를 사용하는 본 연구와 같은 sequential reaction에서 생각해 볼 수 있는 또하나의 반응 시스템은 두개의 효소를 하나의 recombinant cell내에서 발현시켜 이를 효소원으로 사용하는 방법이 존재한다. 이와같은 시스템은 기질에 비하여 낮은 permeability를 가지는 중간물질의 불필요한 cell간의 이동을 최소화 함으로써 aqueous phase에서의 중간 물질 축적으로 인한 고농도의 titrant의 사용을 최소화 할 수 있는 장점이 있다고 할 수 있다. 이와 같은 시스템의 구축을 위하여 Bacillus로부터 유래된 promoter를 이용하여 두개의 효소를 XL1 BLUE내에서 동시발현 시킨후 이의 발현 정도를 관찰해본 결과는 개별적인 발현을 하였을 경우와 마찬가지로 효율적인 발현이 관찰 됨으로써 이를 유용한 효소원으로 사용할수 있는 발현 시스템임을 알 수 있었다. 이와같은 효소원을 이용하여 각기 발현된 cell을 이용한 시스템과 비교하여 보았을 때, 중간물질의 축적이 현저히 감소하는 결과를 관찰함으로써 예상과 같이 효율적인 반응 시스템을 구축할 수 있었다. 이와같은 co-expressed whole cell reaction도 역시 수학적으로 모사함으로써 결과와 비교하여 분석하였다. 결과로써 model과 실험적 결과는 역시 유의한 결과를 보이는 것을 알 수 있었으며, 이로써 두 가지 경우의 전체 반응 시스템을 분석, 예측할수 있었다. 동시발현의 경우 효소의 양을 임의적으로 결정할 수 없기 때문에 발현된 각 효소의 양을 분석하여보았을 때, 활성비율로써 D-hydantoinase : N-carbamoylase는 1:1.64로써 관찰되었다. 이는 앞서 관찰한 1:1.4 이상의 값을 갖는것으로써 동시발현이라는 점을 배제하여도 효율적인 효소원의 조건을 갖춘것이라 할 수있다. 이를 이용한 결과로써 최적 효소투입량은 50 g/L의 기질의 80% conversion yield를 얻기 위하여서는 D-hydantoinase 활성을 기준으로 하여 5100 U의 효소량이 필요하다는 것을 알 수 있었으며 이는 separatley expressed whole cell reaction에 비해 효율적이라는 것을 알 수 있었다. 역시 동시발현의 경우도 racemization rate와 solubility가 전체 생산성에 중요한 영향을 미친다는 것을 sensitivity analysis를 통하여 분석, 예측할 수 있었다.
이와같은 결과를 종합하여 보았을 때, 반응은 중성 pH조건이 alkaline pH에 비해 유리하다는 것을 알 수 있었다 그러나 racemization rate의 감소를 고려한다면 이를 증가시키는 방법으로 hydantoin 유도체에 특이적으로 작용하는 racemase의 이용하라든지 solubility를 증가시킬 수 있는 organic solvent의 사용을 고려한다면 전체 생산성을 증가시킬 수있을 것이라 예측되어진다. 또한, alkaline pH에서의 반응성이 N-carbamoylase의 ammonia inhibition에 의해 저해되는 사실을 고려한다면 N-carbamoylase의 inhibition을 제거하는 방향으로 진화시킴으로써 racemization rate가 원활한 alkaline pH에서의 사용도 전체 생산성 향상에 크게 기여할 것이라는 것을 예측할 수 있었다.
