The high-affinity ribose transporter of Escherichia coli is an ABC transporters, composed of the periplasmic binding protein (RBP or RbsB), the transmembrane component (RbsC) and the ATP-binding protein (RbsA). By the previous genetic study the RbsC has been known to interact with RBP as a homodimer. The molecular interaction of RbsC was further investigated c in this work by in vivo crosslinking and in vitro reconstitution. The RbsC proteins differently labeled with fluorescent dyes were reconstituted into membrane vesicle, and FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) between two dyes was measured to show that the dyes are located in close proximity. In order to demonstrate that RbsC itself can bind Dribose, intrinsic fluorescence of RbsC in a micelle structure was monitored with an addition Dribose, and Kd of RbsC was determined as 3.8mM. The purified RbsA showed a constitutive ATPase activity, which implies that RbsA need to interact with RbsC for the control of hydrolysis cycle. To study the functional interaction between RBP and RbsC, mutant RBP that is active without RbsA was exploited. The binding of mutant RBP induced an increase in RbsC intrinsic fluorescence while that of wild type RBP decreased the fluorescence. The results implies that the mode of association between mutant RBP and RbsC may be different from that of wild type RBP and RbsC, which is responsible for its RbsA-independent growth phenotype.
대장균의 고친화계 리보스 수송계는 ABC형 수송계 중의 하나로, 리보스 결합단백질 (RBP), 막 단백질 (RbsC), ATP가수분해 단백질 (RbsA)로 이루어져 있다. 이전의 유전학적인 연구를 통해, RbsC는 상동 단백질 두개의 결합체로 RBP와 서로 상호 작용한다는 것이 제시되었다. 본 연구에서는 세포시스템 내에서의 교차결합법과 정제된 단백질과 지질로 세포 단백질 막을 시험관 내에서 재구성하는 실험을 통해 RbsC와 다른 구성원들간의 상호작용을 조사하였다. 그 결과 RbsC가 실제로 상동 단백질 두개의 결합체로 존재하고 있음을 밝혔으며, 리보스를 첨가해 주면서 단백질의 자체형광을 조사함으로써 RbsC가 결합단백질 없이도 리보스에 직접 결합할 수 있다는 것이 밝혀졌다. RbsA는 막 단백질과 결합된 상태에서는 리보스의 첨가에 의해서만 활성이 생기는 데 반해, 따로 분리 정제된 RbsA는 지속적으로 활성을 보였다. 이는 RbsA의 활성의 조절을 위해서는 막 단백질과의 상호결합이 필요함을 보여주는 결과이다. 리보스 결합단백질과 막 단백질간의 상호작용을 조사하기 위하여, RbsA없이도 리보스 최소배지에서 자랄 수 있는 돌연변이 리보스 결합단백질이 사용되었다. 돌연변이 단백질은 리보스에 대한 결합 친화도가 상당수준 감소했으나 막 단백질 RbsC와 결합할 수는 있는 것으로 밝혀졌다. 또한 야생형의 결합단백질과 돌연변이 단백질을 각각 막 단백질과 결합시켰을 때 막 단백질의 자체형광을 조사한 결과, 돌연변이 단백질의 경우 자체형광이 증가하고 야생형의 경우 자체형광이 감소하는 것을 관찰하였다. 이는 야생형의 리보스 결합단백질과 돌연변이 단백질의 RbsC에 대한 상호작용의 방식이 다를 수 있음을 제시한다.
