Acid ceramidase (EC 3.5.1.23; N-acylsphingosine amidohydrolase) is the lysosomal enzyme required for the hydrolysis of N-acyl linkage between the fatty acid and sphigosine moieties in ceramide. Inheritent deficiency of this enzymatic activity results in the lipid storage disorder, Farber disease. Computer-assisted database analysis showed that two genomic sequences (designated as K11D2.2 and F27E5.1, respectively) homologous to human acid ceramidase (hAC) from C. elegans may encode hypothetical proteins (393 and 401 amino acid, respectively) that have ~35% identity to hAC. We could measure acid and neutral ceramidase activity in worm lysates using 14C-labeled palimtoyl-sphingosine as a substrate. The acid and neutral ceramidase activities were about 200 pmol/mg/hr each. Based on the high sequence homology between the two hypothetical proteins and acid ceramidase, we started this study to characterize those two sequences further. From a C. elegans cDNA library, we could isolated cDNAs encoding the hypothetical proteins and then renamed the gene as cac-1 and cac-2. The full-length cAC-1 and cAC-2 cDNA were 1,274 bp and 1,295 bp, respectively, and contained an open-reading frame encoding a 393 and a 401 amino acid polypeptide. cAC-1 and cAC-2 showed 37 and 33% identity and 62 and 56% similararity to the hAC polypeptide over its entire length. Comparison of the cDNA and genomic sequences revealed that cac-1 and cac-2 consist of 4 exons and 8 exons, respectively. The 5'' and 3'' untranslated regions (UTR) of cac-1 were 11 and 81 bp, respectively and those of cac-2 were 7 and 56 bp, respectively. Northern blot analysis showed that 1.3 kb cac-1 transcripts were expressed only in the post-embyonic stages of worms. However, we could hardly detect cac-2 transcripts. Transient transfection of recombinant plasmids expressing cAC-1/Myc and cAC-2/Myc fusion proteins to human 293-T cells led to a 1.6- and 3-fold increase in acid ceramidase activity of 293-T cells. Western blot analysis showed that 48 kDa fusion proteins were expressed from both of the plasmids. Fast atomic bombardment (FAB) mass spectrometry revealed that both of the cAC expression changed the contents of several lipid species in 293-T cells to some degree. Especially cAC-1 expression seemed to change the contents of the lipid species, possibly cermides and sphigomyelins.'
Acid ceramidase (EC 3.5.1.23; N-acylsphingosine amidohydrolase)는 라이소좀에 존재하는 효소로서, 세라마이드 (ceramide) 내의 N-acyl linkage 를 가수분해하여 지방산과 스핑고신 (sphingosine)을 생성시키는데 필요하다. 이 효소의 활성이 유전적으로 결함이 생기면 세포내 지방질의 저장에 이상이 생기는 Farber disease가 발병한다. 컴퓨터를 이용해 사람의 acid ceramidase (hAC) 와 유사성이 있는 유전자서열들을 찾아본 결과, 선충류인 C. elegans로부터 두 개의 염색체 서열 (K11D2.2 와 F27E5.1로 명명되어 있슴)을 얻었다. 이 두 유전자 서열은 각각 차례대로 393개와 401개의 아미노산으로 이루어진 예상 단백질을 코딩하고 있었는데, 이 두 단백질들은 사람의 hAC와 각각 약 35%정도의 동일함을 보였다. 14C 방사성 물질로 표지된 팔미토일 스핑고신 (14C-labeled palimtoyl-sphingosine)을 기질로 이용한 효소활성 실험을 통해 C. elegans 에 약 200 pmol/mg/hr 의 acid 와 neutral ceramidase 활성이 존재한다는 것도 확인하였다. 검색된 두 개의 염색체 서열들의 hAC에 대한 높은 유사도에 근거하여, 두 염색체 서열에 대한 추가적인 연구를 진행하였다. C. elegans cDNA library로부터 두 예측 단백질을 코딩하는 cDNA들을 클로닝할 수 있었고 이들의 이름을 C. elegans의 acid ceramidase라는 의미로 순서대로 cac-1과 cac-2로 명명하였다. cac-1과 cac-2 cDNA의 총 길이는 각각 1,274 bp와 1,295 bp 였고, 차례대로 393 개와 401개의 아미노산을 코딩하는 커다란 단일 open reading frame (ORF)이 존재하였다. cAC-1과 cAC-2는 hAC에 대해 각각 37과 33% 동일하고, 62와 56% 유사함을 보였다. cDNA 염기서열을 염색체상의 서열과 비교하여 cac-1와 cac-2가 각각 4개와 8개의 엑손(exon)을 가지고 있슴을 알 수 있었다. cac-1 의 5''과 3'' 말단에 각각 11개와 81개 길이의 서열이 translation 되지 않는 구간 (UTR)으로 존재함을 확인하였다. cac-2의 경우에는 각각 7와 56 bp 였다. Northern blot 실험을 통해서 1.3 kb의 cac-1 전사체가 post-embyo 단계에서만 발현됨을 알 수 있었다. 하지만 cac-2 전사체에 대한 확인은 하지 못하였다. cAC-1/Myc과 cAC-2/Myc 융합단백질을 사람콩팥 293-T 세포에서 발현시킨 결과, 세포의 acid ceramidase 활성이 각각 1.6 배와 3배 증가하였다. 단백질의 생성은 Western blot 실험으로 두 발현벡터 모두 48 kDa의 융합단백질의 발현을 확인하였다. 두 cAC 모두, 발현된 293-T 세포의 여러 지질의 양을 변화시켰슴을 fast atomic bombardment (FAB) mass spectrometry를 이용해 확인하였는데, 특히 cAC-1이 발현된 세포에서는 ceramide 와 sphingomyelin 의 가능성이 있는 지질의 양이 감소하였고, 이는 cAC-1에 의한 변화로 보인다.
