Wilson disease(WD) is an autosomal recessive disorder of copper transport. Its general characteristics are defective biliary excretion of copper and impairment in the incorporation of copper in ceruloplasmin. The product of the WD gene is a copper transporting P-type ATPase (ATP7B). The ATP7B gene has 21 exons and encodes a protein of 1465 aminoacids.
The ATP7B protein is localized to trans-Golgi network under steady state condition. An increase in the copper concentration resulted in the rapid movement to cytoplasmic vesicular compartments. This copper-dependent cellular redistribution of the ATP7B protein is also a reversible process. The molecular mechanism underlying the copper-induced changes in the subcellular distribution of the ATP7B protein is unknown.
In this study, we used LexA Yeast-two-hybrid system to screening cytosolic protein which interacts with Wilson protein, affecting copper dependent trafficking of Wilson protein. In this experiment, we found that ATP binding loop specifically interacts with a polypeptide similar to aspartoacylase(AspA). The cDNA was not complete open reading frame, and we could not identify N-terminus. It encoded 212aa and showed 44% identity with aspartoacylase(AspA). Asparto-acylase(N-acetyl-L-aspartate amidohydrolase) specifically hydrolases N-acetyl-L-aspartic acid(NAA) to aspartate and acetate. The invariable His21 and Glu285 residues involved in the catalysis are present in the consensus sequence motifs, GGTHGNE and VNEAAYY. AspA-H also has equivalent Glu in INEAAYY. Because its N- terminus was not complete, we could not identify the motif including His.
AspA is membrane associated protein and The purified AspA activity was enhanced by divalent cations. And the metal binding motifs of CuBD from the wilson protein have affinities to divalent cation. We could inferr that there could be a functional relationship between the AspA homologue and the Wilson protein, if AspA-H has AspA activity. To understand the relationship between the two proteins, full cDNA cloning of AspA homologue and further study would be needed.
윌슨씨병은 구리를 분비하지 못함으로써 유발되는 질환으로 autosomal recessive로 유전된다. 임상적인 특징으로는 bile로의 구리의 분비가 일어나지 못하며, 여러조직으로 필요한 구리를 운반하는데 관여하는 혈장 단백질인 ceruloplasmin의 혈액내 농도가 상당히 감소되어 있는 것이다. 이 윌슨씨병 유전자는 21개의 exon으로 이루어져 있으며 1465개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코딩한다. 윌슨씨병 유전자의 product는 copper-transporting P-type ATPase (ATP7B)로 생체내 일반적을 상태에서는 trans-Golgi에 존재한다. 그러나 구리 농도가 높아지면 세포질로 vesicle형태로 떨어져 나온다. 이러한 구리 농도에 따른 세포 내 위치변화는 가역적인 과정이며 그 바탕의 분자적인 기작에 대해서는 알려져 있지 않다.
이 실험에서는 LexA Yeast-two-hybrid system을 이용하여 구리 농도에 따른 위치변화에 관련하여 윌슨 단백질과 상호작용하는 단백질을 찾고자 하였다. 실험 결과 기존에 알려진 aspartoacylase와 유사한 polypeptide(AspA-H)가 윌슨 단백질의 ATP binding region과 결합하는 것으로 밝혀졌다. 단백질의 N-terminu는 확인하지 못했고, 212개의 아미노산으로 이루어져 있었는데 그 중 aspatoacylase와는 44%의 아미노산이 동일했다. Aspartoacylase(N-acetyl-L-aspartate amidohydrolase)는 N-acetyl-L-aspartic acid를 aspartate와 acetate로 분해하는 효소이다. 이 효소의 His21과 Glu285는 중요한 catalytic site인 것으로 알려져 있으며 각각 GGTHGNE, VNEAAYY의 conserved motif에 존재하고 있다. AspA-H 경우 N-terminus에 존재하는 His은 확인할 수 없었으나 Glu의 경우 유사한 위치의 INEAAYY에서 발견되었다.
Aspartoacylase는 막 구조와 연관되어 있으며 그 활성은 2가 양이온에 의해 높아지는 것으로 알려져 있다. 윌슨 단백질의 경우 구리 이외의 다른 2가 이온에도 친화성을 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서 만약 AspA-H가 aspartoacylase의 활성을 갖는다면 두 단백질간에 활성에 대한 상호작용이 있을 것으로 기대된다. 이러한 가설을 증명하기 위해서는 우선 N-terminus를 밝혀야 할 것이며 이후 활성 조사 등 여러가지 실험이 이루어져야 할 것이다.
