The pro-phenoloxidase activating system plays an important role in a defensive reaction in insects. Phenoloxidase (PO) that is generated from pro-phenoloxidase (pro-PO) by the pro-PO-activating system catalyzes the oxidation of phenols to quinones, which are then polymerized non-enzymatically to melanin. This melanin encapsulates invading foreign organisms and immobilizes them. The mature form of phenoloxidase activating enzyme (MPAE) is a serine protease that makes PO from pro-PO. But detail aspects of PO activation mechanism are not understood. Since a large quantity of natural MPAE was not available from nature for study of the PO activation mechanism, an expression system for recombinant MPAE in Escherichia coli was developed in this study. The T7 expression system was used for overproduction of the recombinant MPAE. For the expression of the recombinant MPAE, the DNA fragments of cDNA amplified by PCR were cloned into pET-21a(+) vector. The corresponding recombinant protein expressed from the resulting plasmid in E. coli was detected by SDS-PAGE. The recombinant MPAE had the His-tag in the C-terminal region. The His-tag fusion MPAE was overexpressed and purified by nickel-chelating affinity chromatography. Since the MPAE was overexpressed as an inclusion body in E. coli, affinity column purification was accomplished in denaturing condition. Then the target protein was refolded by using dialysis. The refolded MPAE has amidase activity comparable to that of the natural serine protease, trypsin. The cDNA fragments of pro-PO (typeI and typeII) and pro form of phenoloxidase activating enzyme (PPAE) were also cloned into pET-21a(+) vector. But the recombinant proteins were not overexpressed in E. coli.
이 학위논문 실험에서는 pro-phenoloxidase의 활성화 cascade를 분자수준에서 규명하는데 필요한 phenoloxidase activating enzyme의 활성형 (이하 MPAE), 전구체 (이하 PPAE), phenoloxidase type I (이하 PPO I), phenoloxidase type II (이하 PPO II) 재조합단백질을 만드는 일을 수행하였다. 천연에서 추출하여 얻을 수 있는 단백질의 양이 연구를 수행하는데 부족하여 재조합단백질 제조의 필요성이 제기되었다. 이 단백질을 얻기위한 숙주로는 가장 널리 이용되고 있는 대장균을 사용하였다. 우선 MPAE의 cDNA를 포함하고 있는 pBluescript에 제한효소를 처리하여 cDNA(770bp)를 분리한 뒤 대장균을 발현숙주로 이용할 때 쓰이는 대표적인 발현벡터인 pET-21a(+)에 넣어 대량발현을 유도하려 하였다. 그러나 적절한 제한효소 자리가 없는데다, MPAE의 N-말단은 보존하고 C-말단은 단백질 정제의 효율을 높이기 위한 his-tag융합을 시키기위해 NdeI과 HindIII 제한효소 자리를 도입하려고 이들 제한효소인식 염기서열을 포함한 primer를 만들어 PCR실험을 실시하였다. 온도와 salt농도등 최적의 PCR실험조건을 잡은 뒤 실험하여 MPAE의 cDNA 부분(770bp)을 증폭하였다. 이 cDNA조각에 NdeI과 HindIII를 처리하고 pET-21a(+) 발현벡터에 ligation시켜 재조합 plasmid, pEThis(MPAE)를 만들었다. 이 재조합 plasmid를 대장균 JM109(DE3)에 transformation하여 IPTG를 가해 대량발현을 유도하였다. IPTG농도는 1mM을 사용하였다. 곤충유래 단백질이지만 대장균에서도 대량발현이 됨을 확인하였을 뿐 아니라 대장균내에서 재조합 MPAE가 insoluble한 inclusion body로 존재함을 확인하였다. 이 단백질을 nickel affinity column을 이용하여 정제를 시도하였다. Inclusion body로 떨어지면서 이미 어느 정도 세포내의 다른 단백질과 분리가 되는데다 C-말단에 융합된 his-tag을 이용한 nickel affinity column정제를 하였기 때문에 매우 좋은 순도로 재조합 MPAE를 정제할수 있었다. 이 정제된 단백질을 refolding시키기 위해 dialysis방법을 이용하였다. 점진적인 urea제거를 통한 refolding유도 뿐 아니라 보다 효율적인 conformation 회복을 위해 L-arginine과 산화형, 환원형의 glutathione을 포함한 renaturation buffer로 dialysis를 하고, 단백질을 보관할 수 있는 보관 buffer에서 dialysis를 하였다. 이 단백질 sample을 centricon으로 농축하여 BCA방법으로 단백질 농도를 측정하였는데, 약 0.5㎍/㎕의 농도 값을 가졌다. 이 농도의 재조합 MPAE로 활성 test를 실시하였다. Amidase activity test를 실시하였는데 amidase activity를 갖고 있는 대표적인 serine protease인 trypsin과 유사한 정도의 활성을 나타내었다. 이 tset결과로 볼 때 제대로 refolding실험이 이루어졌음을 알 수 있었다. 이 재조합단백질은 in vitro reconstitution system의 한 component로서 앞으로 pro-phenoloxidase의 활성화 mechanism을 밝히는데 이용될 것이다. 먼저 요약한 MPAE 경우와 마찬가지로 PPAE와 PPO I과 PPO II도 각 cDNA를 PCR실험을 하여 증폭한뒤 pET-21a(+)에 넣어 대량발현을 유도하려 하였다. 이렇게 만들어진 재조합 plasmids pEThis(PPAE), pEThis(PPO1), pEThis(PPO2)를 BL21(DE3) 균주와 JM109(DE3) 균주에 transformation하여 IPTG를 가하여 보았으나 대량발현을 관찰할 수 없었다. 이들 단백질의 효율적인 발현을 위한 새로운 방법을 강구해야 하겠다.
