Contamination of water by cyanobacteria (blue-green algae) is a health threat because of their production of toxic peptides, termed microcystins. The primary target organ for microcystins is liver, but other cellular targets have not been elucidated. In the present study, the effect of microcystins on immune functions was investigated. Representative microcystin compounds, microcystin-LR (MC-LR), microcystin-YR (MC-YR) and nodularin, produced dose-dependent inhibition of in vitro polyclonal antibody response and lymphoproliferative activity to LPS. MC-YR and nodularin decreased lymphoproliferative response to ConA, whereas MC-LR showed no significant effect. Intraperitoneal administration of nodularin produced an inhibition of primary humoral immune responses to the T-cell dependent antigen, sRBC. Interleukin-2 (IL-2) protein secretion in phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) plus ionomycin (Io)-induced splenocytes was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which was decreased by the microcystins treatment. When IL-2 mRNA expression was evaluated by quantitative/competitive RT-PCR, microcystins (MC-LR, MC-YR, and nodularin) decreased IL-2 mRNA expression in murine splenocytes and thymocytes in time- and dose-related manner. But no apparent effect by microcystins was observed in EL-4 T-cells. To further characterize the inhibitory mechanism of IL-2 expression by microcystins, IL-2 mRNA stability and the binding activities of transcription factors were evaluated. MC-LR, MC-YR and nodularin led to more rapid destabilization of the expressed IL-2 mRNA. Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) showed that nodularin reduced the NF-AT binding activity in PMA/Io-stimulated mouse splenocytes, but no significant effect was observed on AP-1, NF-kB, and Oct binding activity. Based on the fact that IL-4 gene expression is controlled by NF-AT, the effect of nodularin on IL-4 mRNA expression was measured. Nodularin also inhibited IL-4 mRNA expression in PMA/Io-stimulated murine splenocytes. These results suggest that lymphocytes are direct cellular target of microcystins, and the malfunction of lymphocytes by microcystins is related with down-regulation of the IL-2 and IL-4 expression mediated through the reduced NF-AT activity.
Cannabinoids are a broad family of structurally related compounds derived from the plant, Cannabis sativa, or more commonly referred to as marijuana. In addition to the CNS-altering effects, cannabinoids have been known to alter immune functions. Based on the fact that IL-2 and IL-4 mediate the various immune functions, in the present study, cannabinoids-induced regulatory mechanism for the expression of those cytokines was investigated. Prototype compounds of cannabinoids, cannabinol (CBN) and Delta9-tetrahydrocannabinol ($Δ^9-THC$) inhibited IL-2 gene expression and secretion by PMA/Io-activated mouse splenocytes, thymocytes and EL-4 T-cells in a dose dependent manner. CBN and $Δ^9-THC$ also inhibited IL-4 protein secretion and gene expression in PMA/Io-induced splenocytes, thymocytes and EL-4 T-cells. The inhibition of IL-2 production by CBN and $Δ^9-THC$ was mediated through the repression of IL-2 gene transcription. Moreover, EMSA demonstrated that CBN and $Δ^9-THC$ markedly inhibited the DNA binding activity of NF-AT and AP-1, and to a lesser degree Oct, in a time and concentration dependent manner in activated EL-4 cells. The inhibitory effects produced by CBN and $Δ^9-THC$ on AP-1 DNA binding were quite transient showing partial recovery by 4 hr after cell activation and no effect on the activity of a reporter gene under the control of AP-1. Conversely, cannabinoids (CBN and $Δ^9-THC$)-mediated inhibition of NF-AT was robust and sustained as demonstrated by a NF-AT-regulated reporter gene. Anandamide, putative endogenous ligand to cannabinoid receptor, also showed inhibitory effect on the transcriptional activation of IL-2 and NF-AT in EL-4 cells. Collectively, these results suggest that cannabinoids suppressed IL-2 and IL-4 gene expression and the decreased IL-2 production by cannabinoids is due to the inhibition of transcriptional activation of the IL-2 gene through a transient inhibition of AP-1 and a sustained inhibition of NF-AT.
식수원에서의 남세균 (blue-green algae; cyanobacteria)의 오염은 사람 및 가축에게 큰 위해요인이 되며, 죽음까지도 유발하게 된다. 이러한 독성 효과는 남세균이 생성하는 독소인 마이크로시스틴 (microcystins)에 기인한다. 고리형 펩티드 구조의 마이크로시스틴은 세포내로의 도입에 수용체를 필요로 하여 지금까지는 간에서의 독성작용만이 보고되었다. 본 연구에서는 B6C3F1 마우스를 이용하여 마이크로시스틴이 면역계에 미치는 영향을 알아보고, 대표적인 마이크로시스틴인 microcystin-LR (MC-LR), microcystin-YR (MC-YR)과 nodularin에 의한 면역기능 조절과 그 작용 메카니즘을 규명하고자 하였다. MC-LR, MC-YR, 그리고 nodularin은 mitogen들에 의해 유도된 면역세포의 증식반응을 억제하였다. 그러나 그 작용양상에는 차이가 있어서, MC-LR은 LPS에 의해 유도된 B-세포의 증식반응은 억제하였으나, ConA에 의해 유도된 T-세포의 증식반응에는 영향이 없었다. 반면, MC-YR과 nodularin의 경우에는 T-세포에 더 민감하게 작용하여 증식반응을 억제하였다. 이것은 각각의 마이크로시스틴이 B-세포 또는 T-세포에 대한 민감성이 다르며, 그 작용양상도 차이가 있을 것임을 시사한다. MC-LR, MC-YR, 그리고 nodularin은 모두 in vitro 상에서 비장 세포에서의 항체 형성 능력을 감소시켰으며, nodularin의 경우는 in vivo 상에서 T-세포에 의존적인 항체 형성 능력을 저해하였다. 이러한 면역기능 억제의 기작을 연구하기 위해서 마이크로시스틴이 면역활성에 필수적인 cytokine인 인터루킨-2 (IL-2)와 인터루킨-4 (IL-4)의 유전자 발현에 미치는 영향을 알아보았다. 마이크로시스틴들 (MC-LR, MC-YR, nodularin)은 비장세포에서 phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)와 ionomycin (Io) 에 의해 유도된 IL-2 단백질 분비 및 mRNA의 발현을 시간 및 농도의존적으로 억제하였다. PMA/Io에 의해 유도된 흉선세포에서의 IL-2 mRNA의 발현 또한 MC-LR, MC-YR, 그리고 nodularin에 의해 억제되었으나, EL-4 T-세포에서는 영향이 없었다. 마이크로시스틴의 세포내 도입에는 수용체가 필요하다는 사실에 근거하여, 이러한 결과는 마이크로시스틴 수용체가 비장세포 및 흉선세포에서는 존재하지만, EL-4 T-세포에서는 존재하지 않을 수 있음을 시사한다. 비장세포에서 마이크로시스틴은 발현된 IL-2 mRNA의 불안정화를 촉진하였으며, 이것은 마이크로시스틴에 의한 IL-2 mRNA 감소의 한 원인으로 제시될 수 있었다. IL-2 유전자의 전사를 조절하는 전사인자들인 NF-AT, AP-1, NF-kB와 Oct의 활성에 대한 영향을 electrophoretic mobility shift assay (EMSA)를 이용하여 알아본 결과, NF-AT의 결합활성이 nodularin에 의해 저해됨을 알 수 있었다. 이것은 NF-AT가 매개하는 IL-4 mRNA의 발현 역시 nodularin에 의해 억제된다는 결과와 부합하였다. 이러한 결과들은 마이크로시스틴은 간에서 뿐만 아니라 면역계에서도 영향을 미치며, 면역세포에서의 독성작용은 NF-AT 활성의 억제를 통한 IL-2 및 IL-4 생산의 저해를 통하여 나타난다는 것을 시사한다.
마리화나로부터 유도된 화합물인 카나비노이드는 중추 신경계에 서의 작용 및 면역계에서 adenylate cyclase를 억제한다는 사실이 알려져 있다. 본 연구에서는, 면역기능을 매개하는데 있어서 IL-2와 IL-4의 작용이 매우 중요하다는 사실을 바탕으로, 카나비노이드에 의한 IL-2와 IL-4의 유전자 발현 및 그 조절 메카니즘을 규명하고자 하였다. 카나비노이드의 원형인 cannabinol (CBN)과Delta9-tetrahydrocannabinol ($Δ^9-THC$)의 면역기능 조절 기작을 알아보기 위하여 IL-2 생산에 미치는 영향을 측정하였다. PMA/Io으로 활성화 시킨 B6C3F1 마우스의 비장세포와 흉선세포에서 CBN과 $Δ^9-THC$는 IL-2 단백질의 분비를 농도의존적으로 감소시켰다. EL-4 세포에서도 CBN의 처리는 IL-2 단백질의 분비 및 mRNA의 발현을 억제하였으며, 이것은 IL-2 promoter를 통한 전사과정의 억제를 통하여 일어났음을 알 수 있었다. 카나비노이드에 의한 IL-2 유전자의 전사과정의 조절 기작을 알아보기 위하여, EL-4 세포에서 전사인자들인 NF-AT, AP-1, NF-kB, Oct의 활성에 대한 영향을 평가하였다. PMA/Io으로 유도된 각 전사인자들의 결합활성은 EMSA를 이용하여 측정하였으며, 그 결과 CBN과 $Δ^9-THC$는 NF-AT의 결합활성을 두드러지게 시간 및 농도 의존적으로 감소시켰다. CBN과 $Δ^9-THC$는 AP-1의 결합활성을 활성화 초기에는 억제하였으나, 그 억제현상은 시간에 따라 회복되는 경향을 보여 주었다. CBN과 $Δ^9-THC$에 의한 Oct의 결합활성의 억제는 미약하게 나타났다. NF-kB의 결합활성은 PMA/Io 처리 1시간 이후에는 영향이 없었으나, 활성화 1시간 이전에서는 결합활성이 CBN과 $Δ^9-THC$에 의해 오히려 증가하는 결과를 보였다. 다른 전사인자들과는 달리 나타난 NF-kB에서의 카나비노이드의 작용은 세포 배양시 사용한 혈청의 종류와 농도에 따라 상반되게 나타났고, 이는 CBN이 PKC의 활성을 높였다는 결과와 잘 부합하였다. 각 전사인자들에 대한 promoter의 활성에 대한 CBN의 영향을 측정한 결과, CBN은 NF-AT의 promoter의 활성을 억제하였으며, NF-kB promoter의 활성에는 영향을 미치지 못하였다. AP-1 promoter의 활성은 CBN에 의하여 영향을 받지 않았는데, 이것은 CBN에 의한 AP-1 결합활성의 억제가 시간에 따라 회복되는 경향을 보여준 결과를 뒷받침 해줄 수 있었다. 카나비노이드에 의한 NF-AT 활성의 억제현상은 NF-AT가 매개하는 IL-4의 발현 역시 CBN과$Δ^9-THC$에 의해 억제된다는 결과를 통하여 확인되었다. 이러한 결과들은 카나비노이드가 NF-AT와 AP-1 전사인자들의 활성의 저해를 통하여 IL-2와 IL-4 유전자 발현을 억제한다는 것을 시사한다.
