Ribonuclease P (RNase P) is a tRNA biosynthetic enzyme that participates in the 5' terminal maturation of tRNAs. In Escherichia coli, it is composed of a catalytic RNA subunit and a protein cofactor, called M1 RNA and C5 protein, respectively. The presence of the C5 protein brings about a variety effects on the RNase P catalysis, whereas M1 RNA can cleave the precursor of tRNAs, under nonphysiological high concentration of salts, in the absence of the protein subunit in vitro. For molecular analysis of the C5 protein function, the protein was obtained in a hybrid form fused to the carboxyl terminus of maltose-binding protein (MBP). The fusion protein, MBP-C5, was easily overproduced in E. coli cells and did not show toxicity for the cell viability that was observed in the overproduction of native C5 protein. The fusion C5 protein was readily purified in a single affinity chromatography using amylose resin. The purified MBP-C5 fusion protein was highly soluble at various working buffers. The functional activity of the fusion protein was tested by its ability to stimulate the activity of M1 RNA in low-ionic strength buffer in vitro and to suppress the growth defect of the thermosensitive rnpA49 mutant strain at nonpermissive temperatures. For in vitro catalytic reaction, authentic M1 RNA, 377-nt in length, was constructed by site-directed mutagenesis under SP6 RNA promoter, and the precursor of $tRNA^{Phe}$ was also constructed as the substrate. Using the fusion system of MBP-C5 protein, four deletion mutants of C5 protein were constructed (C5Δ33, C5Δ72, C5Δ80, and C5Δ106). The smallest mutant C5Δ33 carrying only the proposed unique RNA-binding motif (RNR) did not show the ability to restore the enzymatic activity of M1 RNA. However, they were able to stimulate M1 RNA when either the N- or C-terminal region of C5 protein was combined to the RNR motif as in C5Δ72 or C5Δ80. These results suggest that the RNR motif and the adjacent suggested cleft domain in the C5 protein are important in the specific interaction with M1 RNA and in the functional stimulation of M1 RNA.
Correct RNA-protein Interactions in the RNase P holoenzyme are important in the functionality and substrate specificity of the catalytic RNA. High-affinity RNA ligands were isolated by the SELEX procedure (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) from a highly degenerate library on the basis of their ability to bind tightly to E. coli RNase P protein, C5. The 120-nucleotide library consisted of a 42 nucleotide randomized region flanking with the defined sequences at both sides. After fifteen cycles of selection and amplification, the RNA pool was bound to C5 protein with a dissociation constant of ~1 nM. About 100 clones of RNA aptamers were isolated from the selected RNA pool and sequenced. They were categorized into 17 groups with their sequence similarity. The RNA ligands also fell into two classes depending on the affinity to the C5 protein, high-affinity and low-affinity ligands. The high-affinity RNA aptamers have the binding affinities similar to that of M1 RNA. They contain relatively high contents of various stem-loop structures including bulges or internal loops, but show few detectable identical primary sequences. Most of the high-affinity aptamers were able to inhibit the catalytic activity of RNase P holoenzyme. The properties of the selected RNA aptamers show the presence of various RNA motifs capable of binding to C5 protein, implying that C5 protein may participate in other cellular metabolism by binding some cellular RNA molecules besides M1 RNA in vivo. The RNA aptamers also can be used as a tool to understand the basis of RNA-protein interaction in the RNase P holoenzyme.
Ribonuclease P (RNase P)는 성숙한 tRNA 분자의 5''-말단을 완성시키는 데 관여하는 유일한 생합성 효소이다. 이 효소는 촉매역할을 담당하는 RNA 성분과 단백질 보조인자로 이루어져있다. 대장균 RNase P의 경우 377-nt 길이의 M1 RNA와 14 kDa의 C5 단백질로 이루어져있다. M1 RNA는 시험관내에 적당한 완충용액에서 단백질 성분이 없이도 효소적 촉매작용을 발휘할 수 있다. 그러나, C5 단백질은 RNase P 효소작용에 다양한 영향을 준다는 사실이 알려있다. C5 단백질의 기능적 역할을 이해하기 위해서 이 단백질을 말토스-결합 단백질 (MBP)의 C-말단에 연결시킨 융합단백질 (MBP-C5) 을 얻었다. 이 융합단백질은 대장균 세포내에서 쉽게 과량으로 발현하였다. 특히 C5 단백질의 세포내 과잉생산의 경우 나타나는 세포 성장 저해현상이 MBP-C5의 경우는 나타나지 않았다. 융합단백질은 아밀로즈 수지를 사용한 친화성 크로마토그래피 실험에 의해서 용이하게 과량으로 얻을 수 있었다. 정제된 MBP-C5 융합단백질은 다양한 일반적 완충용액에서도 상당한 용해도를 보였다. 이 단백질의 기능적 활성은 생체내에서의 작용과 시험관내에서의 실험을 통해서 확인했다. 이 융합단백질은 온도감수성 rnpA49 돌연변이의 43℃의 비허용 온도에서의 성장 결함을 보완하였고, 또한 낮은 이온세기의 완충용액에서 시험관내 M1 RNA의 활성을 완전히 회복시켰다. 이 실험을 위해서 정확한 길이의 M1 RNA와 $tRNA^Phe$ 전구체를 얻을 수 있는 플라스미드를 구축하였다. MBP-C5 융합단백질을 이용하여, 네 개의 절단된 C5 단백질을 얻었다 (C5Δ33, C5Δ72, C5Δ80와 C5Δ106). 가장 짧은 길이의 C5Δ33 단백질은 특이한 RNA-결합부위, 즉 RNR 영역을 가지는데 M1 RNA의 효소활성을 유도하지 못하였다. 그러나, C5 단백질의 N- 또는 C-말단의 영역이 RNR 부위와 결합될 경우 (C5Δ72 또는 C5Δ80) 는 효소활성이 회복되었다. 이 결과는 C5 단백질에 존재하리라 추정되는 RNR 부위와 이웃한 영역부위 (cleft domain)가 M1 RNA와의 특이한 상호작용과 기능적 활성에 중요함을 시사한다.
RNase P 완전효소에서 RNA-단백질간 정확한 상호작용은 촉매인 RNA성분의 기능과 기질특이성에서 중요하다. 대장균 RNase P의 단백질 성분에 대한 SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) 실험과정을 통하여 무작위 서열 RNA 집합체에서 높은 친화성을 가진 RNA aptamers를 선별하였다. 120-nt 길이의 이 집합체는 42-nt의 무작위 서열을 가지며 양쪽 끝은 미리 정해진 서열의 영역이 연결되어 있다. 15회의 선별과 증폭을 통하여 C5 단백질에 약 1 nM의 해리상수를 나타내는 RNA 집합체를 얻었다. 여기서 약 100 개의 RNA aptamers을 확인하여 서열유사성으로 17의 소집단으로 나누었다. 이들을 C5 단백질에 대한 친화성 정도로 다시 두 부류로 나누었다. 높은 친화성을 지닌 RNA aptamers는 M1 RNA의 경우와 비슷한 결합세기를 보였다. 이들은 bulges와 internal loops를 가지는 다양한 stem-loop 구조를 가졌다. 그러나 일차 서열상의 유사성은 상대적으로 낮았다. 대부분의 높은 친화성 RNA aptamers는 RNase P의 효소활성을 잘 저해하였다. 선별된 RNA aptamers는 C5 단백질을 인식하는 작은 크기의 다양한 RNA 구조를 보여, C5 단백질이 M1 RNA 외에도 생체 내에서 다른 RNA 분자와의 상호작용이 가능하리라는 점을 시사한다. 선별된 RNA aptamers는 또한 RNase P 완전효소에서의 RNA-단백질 인식작용을 이해하는 역할을 제공해줄 수 있을 것이다.
