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Characterization of new matrix metalloproteinases inhibitors from westerdykella multispora F50733 = Westerdykella multispora F50733 균주가 생산하는 새로운 메트릭스 금속단백분해효소 저해물질의 특성
서명 / 저자 Characterization of new matrix metalloproteinases inhibitors from westerdykella multispora F50733 = Westerdykella multispora F50733 균주가 생산하는 새로운 메트릭스 금속단백분해효소 저해물질의 특성 / Ho-Jae Lee.
저자명 Lee, Ho-Jae ; 이호재
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2000].
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Matrix metalloproteinases (MMPs) have been implicated in a variety of disease states, including rheumatoid arthritis, periodontal disease, tumor invasion, and metastasis. In the MMP family, MMP-2 (gelatinase A) is unique in its ability to cleave type Ⅳ collagen, a principal structural components of basement membrane, and has been focused on as a pharmacological target. Consequently, specific inhibitors of MMP-2 may be of value in the therapy of cancers as well as other disease states involving tissue remodeling. ProMMP-2 was purified from a conditioned media of T98G human glioblastoma cells. Tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2) complexed proMMP-2 and TIMP-2 free proMMP-2 were separated by heparin affinity HPLC. The proMMP-2 was homogeneous on SDS-PAGE, with a molecular weight of 64-kDa without reduction. In addition, TIMP-2 and proMMP-2 were separated from the TIMP-2 complexed proMMP-2 by reverse phase HPLC in the presence of trifluoroacetic acid. Two high-throughput screening assay methods were developed with the purified proMMP-2. As results, a fluorescence detection method using 96-well microplate was used as a primary screening system and a direct reaction injection method was used for the confirmation of inhibitory activities of screening samples. In the course of screening for MMP-2 inhibitors from fungi, a fungal strain F50733 was selected. The strain F50733 was identified as Westerdykella multispora on the basis of its cultural and morphological characteristics. The inhibitors of MMP-2, designated gelastatins A and B, and their precursor, dykellic acid were isolated from the culture broth of W. multispora F507343 by successive chromatographies and preparative HPLC. The structures of gelastatins A and B, and dykellic acid were determined by spectroscopic analysis of UV, IR, FAB-MS, $^1H-$, $^{13}C-NMR$, DEPT, HMQC, HMBC, and NOESY. Gelastatins A and B were determined to be 3-(5E-hexa-2E,4E-dienylidene-2-oxo-5,6-dihydro-2H-pyran-3-yl)-propanoic acid and 3-(5Z-hexa-2E,4E- dienylidene-2-oxo-5,6-dihydro-2H-pyran-3-yl)-propanoic acid, respectively. Dykellic acid was determined to be 3-(5-methylene-2-oxo-6-penta-1E,3E-dienyl-5,6-dihydro-2H-pyran-3-yl)-propanoic acid. The single crystal X-ray crystallographic analysis confirmed the structure of dykellic acid and also indicated that dykellic acid is racemic. The biosynthetic origin of the carbon atoms of dykellic acid was unambiguously determined by feeding experiments using $^{13}C$-labeled precursors followed by $^{13}C$-NMR analysis of the isolated products. These results demonstrated that the carbon skeleton of dykellic acid is derived from hexaketide intermediate due to head-to-tail condensations of six acetate units and exo-methylene carbon and lactone carbonyl carbon are derived from the methyl group of methionine. The inhibitory activities of gelastatins A and B against different MMPs were determined using fluorescent synthetic peptide substrate. Gelastatins A and B inhibited MMP-2, -9, and -14 with and $IC_{50}$ value of 0.63, 5.29, and 6.40 {$\mu$ M},respectively. The steady-state kinetic experiments indicated that the inhibition of MMP-2 by gelastatins A and B is competitive with respect to substrate. The Km value for substrate is $6.39\times10^{-6}M$ and Ki value for gelastatins A and B is $6.90\times10^{-7}M$. Gelastatins A and B did not show any significant in vitro cytotoxicity in a variety of human cancer cell lines tested. In order to investigate the effects of gelastatins A and B on cell invasiveness, in vitro tumor cell invasion assays were performed with highly invasive B16-F10 murine melanoma cells. Gelastatins A and B inhibited the invasion of reconstituted basement membrane Matrigel by B16-F10 cells dose dependently with an $IC_{50}$ value of 9.50 ㎍/ml. In an attempt to improve the potency of MMP inhibitory activities, the chemical modifications of the zinc-binding group (ZBG) of inhibitors were performed. The modification of carboxylic acid moieties of gelastatins A and B into methylester derivatives has resulted in the loss of the inhibitory activities against MMPs. This result indicated that the carboxylic acid moieties of gelastatins A and B should be the ZBGs of the inhibitors. As the carboxylic acid moieties of gelastatins A and B were replaced by hydroxamic acid moieties, the inhibitory activities against MMPs, such as MMP-2, -9, and -14, were gained about 2 order of magnitude. The modification of dykellic acid into hydroxamic acid derivative also showed potent inhibitory activities against MMPs. Gelastatins A and B and their proto-inhibitor, dykellic acid are novel fungal metabolites. Especially, gelastatins A and B are non-peptidic inhibitors of MMPs. Therefore, more detailed study on the structure-activity relationship of gelastatins will provide new insights into the development of potent and selective inhibitors of MMPs.

암의 치료에 있어서 가장 큰 장벽이고 암 환자의 주된 사망요인이 되는 것은 암세포의 전이에 의한 것이다. 암세포의 침윤과 전이에 있어서 중요한 부분은 암세포가 정상적으로 통과할 수 없는 지지구조체인 기저막 (basement membrane)과 세포외기질 (extracellular matrix)에 있는 단백질 중합체의 분해이다. 암세포는 이러한 장벽을 분해하기 위하여 여러 종류의 단백분해효소를 분비하는데, 특히 기저막과 세포외기질의 주성분을 분해하는 메트릭스 금속단백분해효소 (matrix metalloproteinase, MMP)가 중요한 역할을 한다. 따라서 저분자의 MMP 저해제는 암의 침윤과 전이를 효과적으로 막을 수 있는 새로운 표적으로 기대된다. 이러한 일군의MMP 효소중에서 MMP-2는 다양한 암조직에서 발현되고 기저막의 주요 구조적 단백질인 type Ⅳ 콜라겐을 분해하기 때문에 저해제 탐색의 표적효소로 이용하였다. 저해제 탐색을 위해 인간 T98G 인간 신경교아세포종 (glioblastoma)의 무혈청 배양액으로부터 MMP-2를 분리하였다. 분리된 MMP-2를 이용하여 신속하고 재현성있는 저해제 탐색방법을 개발하였다. 형광합성기질을 이용한 형광검출법을 1차 탐색법으로 이용하였고, 효소반응액을 직접 HPLC를 통해 저해활성 검증하는 법을 2차 탐색법으로 이용하였다. 이러한 탐색법을 통해 곰팡이 배양액으로부터 MMP-2 저해물질을 탐색하는 과정에서 강한 저해활성을 나타내는 F50733 균주를 선정하였다. 이 균주는 배양학적, 형태학적 특성을 통해 Westerdykella multispora로 동정되었다. 본 균주의 발효액으로부터 에틸아세테이트 추출, 다양한 컬럼 크로마토그래피와 HPLC로서 저해물질, gelastatin A와 B, 그리고 저해물질의 전구체인 dykellic acid를 분리하였다. 물질의 물리화학적 특성과 NMR 등의 기기분석을 통해 이들 물질은 모두 신규 화합물로서 gelastatin A와 B는 3-(5-hexa-2E,4E-dienylidene-2-oxo-5,6-dihydro-2H-pyran-3-yl)-propanoic acid 구조의 각각 5E- 와 5Z-의 이성체로 결정되었고, dykellic acid는 3-(5-methylene-2-oxo-6-penta-1E,3E-dienyl-5,6-dihydro-2H-pyran-3-yl)-propanoic acid로 결정되었다. Gelastatin A와 B는 카이럴 컬럼을 통해 분리가 되었으나 다시 서로 이성화 되었다. 또한 dykellic acid는 X선 결정 분석을 통해 구조 (conformation)를 확인하였다. Dykellic acid의 생합성 연구를 위해 W. multispora F50733 균주를 통한 물질 발효생산 과정에서 $^{13}C$로 표지된 전구체를 첨가하여 생산된 물질의 $^[13}C-NMR$ 분석으로 골격을 이루는 탄소원의 기원을 조사하였다. 이 결과, dykellic acid는 6개의 아세테이트 단위체가 축합된 hexaketide 골격으로 유래됨을 확인하였고, 말단 메틸렌 탄소 (C-5a)와 락톤의 카르보닐 탄소 (C-2)는 메티오닌의 메틸기에서 유래됨을 확인하여 dykellic acid를 이루는 14개 탄소의 기원을 모두 확인하였다. Gelastatins (이성체 A와 B)의 MMP 및 다른 금속단백분해효소에 대한 저해활성을 조사한 결과, gelastatins은 MMP-2, MMP-9, 그리고 MMP-14에 각각 0.63 μM, 5.29 μM, 그리고 6.40 μM의 50% 저해활성값 ($IC_{50}$)을 보였고, MMP-1과 MMP-3에 대해서는 선택성이 적었다. 또한 thermolysin, aminopeptidase M과 같은 금속단백분해효소에 대해서는 저해활성이 거의 없었다. MMP-2의 gelastatins에 의한 저해양상은 기질과 경쟁적으로 작용하였으며, 기질에 대한 Km 값은 $6.39\times10^{-6}M$ 이었고, gelastatins에 대한 Ki값은 $6.90\times10^{-7}M이었다. Gelastatins및 dykellic acid의 in vitro 세포독성을 조사한 결과, 실험한 12종류의 암세포주에 대해서 100 ㎍/ml 이상의 50% 생육저해값 ($GI_{50}$)을 보여 세포독성이 매우 낮았다. Gelastatins의 in vitro 암세포 침윤저해를 검토한 결과, 고전이성 흑색종인 B16-F10의 인공적 기저막인 Matrigel의 침윤을 농도 의존적으로 저해하였으며, 9.50 ㎍/ml의 50% 저해활성값 ($IC_{50}$)을 나타내었다. MMP의 저해활성을 증가 시키기 위한 시도로서 효소의 활성부의에 있는 아연 이온과 결합하는 저해제의 아연결합부위 (zinc-binding group)를 화학적으로 변환시켰다. Gelastatins의 카르복실 기를 메틸에스터로 전환한 결과, MMP에 대한 저해활성이 사라져서 gelastatins의 카르복실 기가 아연결합부위로 작용함을 확인하였다. 또한 카르복실 기를 하이드록사믹 산 (hydroxamic acid)으로 전환한 결과, MMP-2, MMP-9, 그리고 MMP-14에 대해 각각 6 nM, 23 nM, 그리고 62 nM의 50% 저해 활성값 ($IC_{50}$)을 보여 gelastatins보다 약 100 배의 활성 증가를 나타내었다. 한편, dykellic acid의 경우에서도 하이드록사믹 산으로 전환한 결과, μM 수준의 저해활성을 나타내었다. 곰팡이로부터 탐색되어 분리한 gelastatins과 dykellic acid는 펩타이드성이 아닌 새로운 골격의 MMP 저해제 선도물질로서의 의미를 가지며, 자세한 구조와 활성간의 관계연구를 통해 암 전이억제제로서의 활성이 우수하고 선택적인 MMP 저해제로의 개발 가능성이 기대된다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DBS 00018
형태사항 xii, 180 p. : 삽도 ; 26 cm
언어 영어
일반주기 Includes appendix
저자명의 한글표기 : 이호재
지도교수의 영문표기 : Joon-Shick Rhee
지도교수의 한글표기 : 이준식
수록잡지명 : "Dykellic acid, a novel apoptosis inhibitor from Westerdykella multispora F50733". Annals of the New York Academy of Sciences, vol. 40, no. 38, pp. 6949-6950
수록잡지명 : Tetrahedron letters
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 생물과학과,
서지주기 Reference : p. 133-145
주제 Matrix metalloproteinase
Inhibitor
Gelastatin
Dykellic acid
Tumor invasion
메트릭스 금속단백분해효소
저해제
젤라스타틴
다이켈릭 산
암 침윤
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