The inducible immune genes against invading microorganisms in the fall webworm, Hyphantria cunea, were studied. Eleven immune-related cDNA clones (Hdd1, Hdd2, Hdd3, Hdd8, Hdd11, Hdd13, Hdd15, Hdd17, Hdd23, Hs106 and Hs302) were isolated and characterized using PCR-based differential display (DD-PCR) and subtractive cloning methods. The deduced amino acid sequence of Hdd2 was shown to be a member of the copper, zinc superoxide dismutase (Cu-Zn SOD) family. The H. cunea Cu-Zn SOD is novel in that it is up-regulated following a bacterial challenge and has a putative signal peptide suggesting its secretion and involvement in the insect immune response. Hdd3 was found to encode a new member of the serpin serine protease inhibitor family. The H. cunea serpin may be involved in the prophenoloxidase cascade by modulating serine protease, which may cleave the maturation site of prophenoloxidase. The putative lectin corresponding to Hdd15 is novel among its class as it has two lectin C domains in a single molecule. These two lectin C domains show significant homology to the lectin C domain of Periplaneta lipopolysaccharide binding protein (LPS-BP). Three cloned genes, Hdd17, Hs106 and Hs302, encode homologues to Bombyx mori Gram negative bacteria binding protein, a hemolin-like protein and a attacin-like protein, respectively. The clone, Hdd8, was identical to the previously described H. cunea cecropin A3. On the contrary, Hdd1, Hdd11, Hdd13 and Hdd23 did not reveal any significant homology with known proteins. Only the deduced amino acid sequences from Hdd11 showed weak homology with a Locusta migratoria hemolymph protein. All of the 10 genes were clearly inducible by Escherichia coli and Micrococcus luteus injection. Injection of distilled water only slightly induced mRNA levels. Comparison of temporal mRNA expression following E. coli injection showed four types of expression patterns; rapid up-regulation followed by rapid down regulation (SOD, serpin, lectin, GNBP, hemolin and cecropin A1), rapid up-regulation with sustained expression (Hdd1, Hdd13, attacin and lysozyme), gradual, but continued up-regulation (Hdd11 & Hdd23) and a final profile of cecropin A3. The upstream study in relation with the expression patterns may provide a clue to insect immune gene regulation.
The H. cunea lectin is a possible candidate for insect immune surveillance against Gram negative bacteria. The lipopolysaccharide binding activities of the recombinant CRD-N and CRD-C (rCRD-N and rCRD-C) were investigated by enzyme-linked immunosorbent assay. The lipopolysaccharide binding of rCRD-N and rCRD-C was pH-dependent: at pH below 6.0, they show higher binding ability to lipopolysaccharide. The binding of the recombinant CRD-N was inhibited by both D-mannose and N-acetyl-D-glucosamine, whereas that of the recombinant CRD-C was inhibited only by D-mannose. The binding of both rCRD-N and rCRD-C to E. coli was mainly mediated through the O-specific chain. These results strongly suggest that it might be a recognition molecule of insect immune response against Gram negative bacteria.
흰불나방으로부터 모두 11개의 면역관련 유전자 (Hdd1, Hdd2, Hdd3, Hdd8, Hdd11, Hdd13, Hdd15, Hdd17, Hdd23, Hs106, Hs302)를 분리하고 그 특성을 규명하였다. 흰불나방 유충에 대수기의 세균현탁액을 주사하여 면역 반응에 관여하는 유전자의 발현을 유도시킨 후 그 발현차이를 나타내는 유전자를 DD-PCR 방법과 Subtractive cloning 방법을 이용하여 분리한 후 각각의 cDNA를 클로닝하고 그 염기서열을 분석하였다. 그 결과 Hdd2, Hdd3그리고 Hdd15는 각각 새로운 종류의 Cu-Zn SOD, serpin 그리고 lectin을 coding하는 유전자임을 알 수 있었다. 흰불나방의 Cu-Zn SOD는 혈림프로 분비되어 곤충의 면역반응 혹은 상처에 대한 반응과정 중 생성되는 superoxide를 제거함으로써 독성을 감소시키리라 추정된다. 흰불나방의 serpin은 prophenoloxidase을 활성화시키는 단백질 분해효소의 활성을 저해함으로써 면역반응의 활성을 조절하리라 추정된다. 흰불나방에서 분리된 lectin은 특이하게도 두개의 carbohydrate binding domains (CRDs)을 가졌으며 Hs302와 Hdd17이 coding하는 hemolin, GNBP와 함께, 외부에서 침입한 그람음성균을 인식하고 면역반응의 신호를 전달할 가능성을 가진 후보 단백질이다. Hs106과 Hdd8은 각각 항생 단백질 혹은 펩타이드인 attacin과 cecropin을 coding하는 유전자였다. 이중 Hdd8의 경우 기존에 보고된 유전자였으나 나머지 10종의 유전자는 모두 흰불나방에서 최초로 보고되는 유전자이다. 기존에 보고된 lysozyme과 cecropin 유전자를 포함하여 이들 면역 유전자는 그람음성균인 대장균을 주사함으로써 그 발현이 유도되었을 때 모두 4가지 형태의 발현양상을 나타내었다. 또한 흰불나방 lectin의 기능분석을 위한 연구로서 각각의 CRD를 대장균에서 발현시켰을 때 각 재조합 단백질은 그람음성균의 LPS와 특정한 결합을 함을 알 수 있었으며 이러한 결합은 LPS의 O-antigen 부위에서 주로 일어남을 확인하였다. 흰불나방 lectin의 두개의 CRD가 각각 LPS를 인식하고 결합한다는 결과로부터 흰불나방 lectin이 외부침입미생물을 인식하는 역할을 할 가능성이 높음을 알 수 있었다. 본 연구로부터 흰불나방에서 10종의 신규 면역 유전자를 확보할 수 있었으며 이들 유전자는 곤충의 면역과정에 대한 더욱 깊은 이해를 위한 연구에 이용될 수 있을 것이다. 또한 면역 유전자가 다양한 발현양상을 나타냄을 확인함으로써 기존에 알려진 발현조절 기작과는 다른 기작이 존재함을 확인하였으며 이들 유전자의 upstream 연구는 곤충의 면역 유전자 조절기작 연구에 도움이 될 것이다.
