N-Acetylglucosaminyltransferase-Ⅲ [EC 2. 4. 1. 144] (GnT-Ⅲ) catalyzes the addition of N-acetylglucosamine in β-1, 4- linkage to the β-linked mannose of the trimannosyl core of N-linked glycans to produce a bisecting glucosamine residue. There are several reports that GnT-Ⅲ expression is elevated in the tissues of hepatic disease and that the GnT-Ⅲ level in the serum of patients with hepatic disease is significantly increased compared to the normal value. The current investigation involves three aspects of human GnT-Ⅲ molecules: (1) Molecular characteristics of GnT-Ⅲ in hepatic cancer cells, (2) immunological/histochemical study of GnT-Ⅲ levels in the serum and tissues of normal vs. hepatic disease, and (3) development of a transgenic murine model which overexpresses human GnT-Ⅲ in the liver.
The GnT-Ⅲ activity in human hepatoma cells (Hep3B and HepG2), normal primary hepatocytes and hepatoma tissues was studied, and observed that GnT-Ⅲ was primarily associated with the cell membranes of Hep3B and HepG2 cells. Using 2 substrates for GnT-Ⅲ, namely, GlcN,GlcN-biant-PA and UDP-GlcNAc, it was founded that the enzymatic activity of GnT-Ⅲ in Hep3B and HepG2 exhibits different characteristics as determined by their respective Km values. Judging from the GnT-Ⅲ activity of the cell extracts, hepatocarcinoma cells contain significantly higher levels of GnT-Ⅲ than that of normal liver cells or primary adult hepatocytes. The mechanism that induces this effect is presently unknown.
To investigate the relationship between human GnT-Ⅲ and development of hepatic disease, the level of GnT-Ⅲ in hepatoma tissues and sera have been determined by both an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the enzymatic activity measurement. To develop an ELISA, aglycosyl-recombinant human GnT-Ⅲ (AGR-GnT-Ⅲ) with molecular weight of about 59 kDa was produced and the protein to generate the monoclonal antibody (GT 273) that is specific for AGR-GnT-Ⅲ was used. The ELISA results showed elevated AGR-GnT-Ⅲ levels in the serum specimens of patients with chronic hepatitis or liver cirrhosis compared to the normal value. In immunohistochemical study, all the hepatoma tissues including the cases of hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma exhibited positive AGR-GnT-Ⅲ expressions. A simplified procedure based on a QAE-Sepharose and an immunoaffinity chromatography technique was developed to purify the endogenous human GnT-Ⅲ in hepatocellularcarcinoma (HCC) tissues. Following the new procedure, the human GnT-Ⅲ in HCC tissues was purified as much as 378-fold. The purified human GnT-Ⅲ can be utilized in development of an ELISA for human GnT-Ⅲ and, also, in the immunohistochemical study of the human liver, kidney or other organ tissues.
Transgenic mouse carrying mouse albumin/human GnT-Ⅲ hybrid gene was produced and characterized by Northern and Western blot analysis, which verified that the transgene is specifically expressed in the liver. These mouse manifested microvesicular fatty changes with abnormal lipid accumulation in the hepatocytes of the liver tissues. Biochemical analysis of the murine serum specimens revealed a slight elevation of the GOT and GPT level, but otherwise comparable levels of serological proteins to those of the normal mouse. The phenotypic and serological characteristics of the transgenic mouse suggest an induction of possibly fatty liver disease and/or dysfunction of lipid metabolism, probably due to the overexpression of human GnT-Ⅲ in the mouse.
In conclusion, the results of this investigation provide a basis for the future analysis of the relationship between human GnT-Ⅲ and the onset/ progression of hepatic pathogenesis.'
간질환 관련 당전이 효소 중 하나인 N-Acetylglucosaminyl-transferase-Ⅲ [EC 2. 4. 1. 144] (GnT-Ⅲ)는 N-linked glycan의 trimannosyl core의 β-linked mannose에 β-1-4-linkage로 N-acetylglucosamine을 첨가하여 bisecting glucosamine잔기를 생성하는 것을 촉매 하는 효소이다. 이 GnT-Ⅲ는 세포증식이 활발한 암화된 세포에서 많이 발현되며 간암, 만성간염, 간경변과 같은 간질환 환자의 혈액에서 그 활성도가 높이 증가된다는 보고가 있다.
본 연구에서는 다음과 같은 3가지 측면에서 인간 GnT-Ⅲ에 대한연구를 실시하였다. 1) 간암 세포주에서 GnT-Ⅲ의 분자생물학적 연구, 2) 간 질환과 정상의 조직과 혈청에서의 면역학적, 조직학적 연구, 3) 간에서 인간 GnT-Ⅲ가 과잉 발현하는 형질전환 동물모델을 통한 기능연구.
이를 위하여 Hep3B와 HepG2와 같은 인간 간암 세포주들, 초기 간암조직과 정상 간 조직에서의 GnT-Ⅲ의 활성도 차이를 비교하였다. Hep3B와 HepG2 세포주에서 GnT-Ⅲ는 주로 세포막에서 발견되었으며 GlcN,GlcN-biant-PA와 UDP-GlcNAc를 기질로 하여 효소 활성도를 측정하였을 때 Hep3B의 Km 값과 적정 pH, 활성도가 HepG2 와 차이를 보였다. 한편, 정상 간세포에서 낮은 효소 활성도를 보인 반면, 간암세포에서는 높은 활성도를 보였다. 이 현상에 대한 정확한 기작은 현재까지 알 수 없다.
인간 GnT-Ⅲ와 간질환 발전단계에서의 상관관계를 알아보기 위하여 효소면역 측정법과 효소활성도 측정에 의해 간암조직과 간질환 환자의 혈청에서 인간 GnT-Ⅲ의 수준을 측정하였다. 효소 면역 측정법을 확립하기 위하여 당기가 없는 (aglycosyl)형태의 재조합 단백질인 AGR-GnT-Ⅲ를 대장균 내에서 대량으로 발현 (59 kDa)시켜 순수한 GnT-Ⅲ 단백질을 정제하였고 AGR-GnT-Ⅲ에 특이적으로 반응하는 단일클론항체를 제조하였다. 여러 질병의 환자로부터 얻은 혈청을 대상으로 효소면역 측정법에 의하여 GnT-Ⅲ를 측정한 결과 정상인 보다 만성감염과 간경변 환자의 혈청시료에서 높은 농도의 GnT-Ⅲ를 측정할 수 있었다. 또한 간 조직에서의 immunohistochemistry를 실시한 결과 정상간에서는 GnT-Ⅲ가 발현되지 않거나 약하게 발현되는 반면 간암조직에서는 강한 발현을 보였다. AGR-GnT-Ⅲ를 대장균에서 재조합 단백질을 제조하였으나 당화가 이루어 지지 않은 단백질이므로 실제 당화된 형태의 인간형 GnT-Ⅲ를 얻기 위하여 QAE-Sepharose와 immunoaffinity chromatography 기술을 기초로 하여 간암조직에서 인간 GnT-Ⅲ를 정제하였으며 효소활성도가 378배 증가되었다.
한편, GnT-Ⅲ의 생물학적 기능을 알아보기 위하여 간에서 특이적으로 GnT-Ⅲ가 과잉 발현하는 형질전환 생쥐를 제작하였으며 Northern과 Western blot 분석 결과 간에만 특이적으로 과잉 발현되는 것을 확인하였다. 이 형질전환 생쥐는 복부가 부른 형태로 성장하였으며 해부한 결과 복부와 간 조직에 많은 지방을 함유하고 있었다. 이들 생쥐를 대상으로 혈액검사를 실시한 결과 정상 쥐 보다 GOT, GPT의 수치가 높았다. 이를 통해 GnT-Ⅲ의 과잉발현은 복부지방을 동반한 지방간을 유발하며 지방대사에 영향을 미침을 알 수 있었다.
본 연구의 연구 결과들은 인간 GnT-Ⅲ와 간질환 발병과 질환의 진전과의 관련성 연구를 위한 기반을 제공한다.
