Genes expressed differentially in hepatocellular carcinomas were screened through PCR-based subtraction and dot hybridization methods. A cDNA clone, 2C06 had been isolated and identified as human S100A6 gene. The nucleotide sequence of the S100A6 cDNA clone consists of 407 nucleotides including the ORF of 270 bases. The ORF codes for a polypeptide of 90 amino acid residues with the deduced molecular weight of about 10 KDa. Computer aided-homology analysis showed that nucleotide sequence of S100A6 shared about 30-40% homology with those of S100 family proteins. Northern blot analysis showed that S100A6 message was highly expressed with high level in the tissues of metastatic hepatocellular adenocarcinoma from colon cancer, cholangiocarcinoma and gallbladder cancer, while the expression levels in primary hepatocellular adenocarcinoma and normal liver tissues were very low. In order to elucidate the function of S100A6 protein, the ORF of S100A6 gene was reconstructed and over-expressed in E. coli cells. Antiserum and monoclonal antibody to the recombinant S100A6 protein were produced from immunized Balb/c mice. The produced monoclonal antibody KO2C12-1 did not exhibit the cross reactivity against several S100 family proteins. The site of antigen recognition was determined by western blot analysis with serially deleted S100A6 proteins. Monoclonal antibody to recombinant S100A6 protein was used to reveal the expression patterns of S100A6 protein in normal and various cancerous tissues of human origin including hepatocellular carcinoma. Immunohistochemical study demonstrated that the tissues of cholangio-carcinoma (CC), gallbladder cancer (GBC) and metastatic hepatocellular adenocarcinoma from colon cancer (McT) were positively stained in nucleus and/or cytoplasm of tumor cells. The distribution patterns of S100A6 protein varied depending on the loci of the cancerous lesions. Tumor cells located at the outskirts of the cancerous lesions were positively stained at cytoplasm. On the other hand, tumor cells located deep in the lesion were positively stained at nucleus. Diverse roles of S100A6 protein are expected in the cells according to the specific locations of the protein. Cell proliferation assay of anti-sense treated CT26 cells indicated that endogenously expressed S100A6 has its roles in promoting of cell growth via a calcium-mediating signal pathway.
S100A6는 칼슘결합 단백질로서 세포내의 칼슘농도의 조절과 신호전달체계에서 매개체로서의 역할을 가지고 있으며 세포의 성장과 밀접한 관련을 가지고 있는 물질이다. S100A6단백질 군은 이 물질은 현재까지 18여종으로 구성되며 각각의 상동성은 약 30-40% 정도이다. 이들 칼슘결합단백질은 2개의 E-F hand motif을 가지고 있고 각각의 종류마다 조직 또는 세포 특이적 발현 현상을 보이는 특징을 가지고 있다.
본 연구에서는 간암조직 특이적으로 발현되는 유전자를 탐색하기 위하여 인체 태아 간 조직 cDNA library에서 얻어진cDNA클론을 대상으로 Dot hybridization 을 실시하였다. 그 결과, 다수의 신규유전자가 암 조직에서 높게 발현되고있음을 확인하였다. 간암조직에서 높은 발현 율을 보이는 유전자들 가운데 S100A6유전자는 특정 간암조직에서 발현이 증가되고 있다는 사실을 발견하였다. 다양한 암 조직과 정상조직에서 S100A6 유전자의 발현현상을 검토하기 위하여 Northern blot analysis를 실시하여 확인한 결과 특정간암조직에서 높은 발현 율을 보였다. 또한 S100A6단백질의 발현분포를 확인하기 위하여 S100A6에 대한 재조합 단백질을 발현벡타 (pGEX-4T)을 이용하여 대장균에서 과발현시켰다. 대장균으로부터 분리 정제하여 얻은 단백질을 면역원으로 사용하여 단일클론항체를 생산하였고 항체를 KO2C12-1이라고 명명하였다. 이 항체의 특징을 분석한 결과 Immunoglobulin M Type 의 항체이며 S100A6 단백질의 N- terminal로부터 47번과 65번 부분을 특이적으로 인지하는 단일클론항체임을 확인하였다. 이 항체를 이용하여 각종 암세포 주와 암 조직의 시료에서 Western blot과 Immunohistochemical staining을 실시하여 본 결과 담관 암 (Cholangiocarcinoma)과 담낭 암 (Gallbladder cancer)에서 특이적으로 발현현상이 높으며 정상조직에서는 거의 발현이 되지않는다는 사실을 확인할 수 있었다. 특히, 담관 암의 경우에 S100A6 단백질의 발현양상은 정상조직과 인접한 부분의 암 세포에서는 세포질에 많이 분포되어있는 반면, 암 조직의 중심부위에 존재하는 암세포에서는 핵 부위에서 발현되고있는 양상을 뚜렷이 보이고있음을 알 수 있었다. 이는 S100A6가 세포 내 역할의 다양성을 지니고 있다는 간접적인 증거를 제시하고 있으며 이 단백질의 과발현은 암의 초기진단 가능성을 제시하고있다.
암화 과정에서 세포 내에 존재하는 S100A6 단백질의 기능을 분석 하기하여 배양중인 세포 내에서 이 단백질을 과발현시켜 세포의 형태학적 변화와 관련 단백질의 탐색을 항체를 이용한 면역침강법 (Immunoprecipitation)과 재조합단백질을 이용한 침강법(Coprecipitaion) 을 활용하여 탐색하였고, 현재 관련단백질의 특성을 분석하고 있다. 또한 세포 내에서 S100A6단백질의 발현을 antisense S100A6 Oligomer로 억제 시킨 후 세포의 변화를 측정한 결과 성장속도가 현저히 낮아졌다. 세포 내에서 S100A6단백질과 결합하는 관련단백질의 탐색연구는 세포의 성장과 암화과정에서 이 단백질의 기능을 분석하는 초석이 될 것이다.
