Cellular immune responses involve the activation of T cells by specific antigens. Thus, a central issue in understanding adoptive immunity is the means by which T cells recognize antigens. While antigen recognition by antibodies has been examined in molecular detail by X-ray crystallography, antigen recognition by T cells is still largely studied through the analysis of biological responses of T cells. The nature of T cell's response to complexes formed by epitope peptides with MHC proteins can be greatly affected by alterations in the peptide's amino acid sequence. Some peptides elicit agonistic responses; others elicit partial responses; and the principal effects of still others is to inhibit the activity of agonists, epitope peptides. These altered peptide ligands (APL) are of considerable interest because they provide the tools for exploring previously unappreciated complexities in the responses of T cells to antigens. To identify and characterize antagonistic peptides for the CD8+ cytotoxic T cell, CTL clones whose T cell receptor(TCR) recognize an epitope in the nucleus protein of Hantaan Virus(HTV) were used as a model system.
Although neutralizing antibodies against Hantaan virus can protect host from viral infection, T cell responses to HTV are also regarded important in host defense against HTV. But much less is known about the cytotoxic T lymphocyte(CTL) responses to HTV. In order to identify CTL epitopes in the HTV nucleocapsid protein(NP), we selected seven H-$2K^b$-motif-fitting peptides. Out of these peptides, 3 peptides(NP3,NP4,and NP7) were recognized by CTL responses derived from HTV-immunized mouse splenocytes. NP3 and NP4 peptide were also recognized by HTV-immunized splenocytes after secondary in vitro stimulation with the relevant peptide, but NP7 could not be recognized after in vitro stimulation. These results agree well with peptide-immunization studies showing that peptide-specific CTL responses could be induced with NP3 and NP4 but not with NP7 peptide. Furthermore CTL activity assay using targets, prepared to express the antigen (NP)endogenously, demonstrated that NP3 and NP4 peptide could be presented endogenously. These results show that NP3 and NP4 are H-$2K^b$-restricted epitope peptides in nucleus protein of HTV.
CTL elicited with NP4 peptide retained some cross-reactivity and was difficult to long-term culture. But NP3-elicited CTL was very specific for NP3 peptide and was stable enough to be cloned. Among many CTL lines elicited with HTV or HTV NP peptides, six NP3-specific CTL clones were established and have been maintained over 2 years. Most of CTL clones were characterized to be CD3+, CD4-, CD8+, CD25+, CD62L-,and NK1.1-,and to use TCR Vb6.This preferential usage of TCR Vb6 indicates that TCR Vb6 regions are important for recognition of the HTV NP3 epitope (NP221-228, SVIGFLAL) on H$2K^b$ molecule. These NP3-specific CTL clones were also confirmed to recognize peptides in H-$2K^b$-restricted fashion by CTL assay using Ala-substituted NP3 peptides for sensitizing of target cells. These data demonstrate, for the first time, the definition of mouse CTL epitopes in HTV and the generation of HTV-specific mouse CTL clones.
Altered peptide ligands were synthesized from HTV NP3 epitope peptide. Possible TCR-binding sites, 4th(Gly) and 7th(Ala) residue, were substituted by other amino acids except for Cys and Trp. Finally 34 APL's were tested for the binding to H-$2K^b$ and the inhibition capacity of CTL activity of HTV NP3-specific CTL clones in the presence of the epitope peptide. In both cases of G4X and A7X, most of APL showed about 80% or more binding capacity to H-2Kb molecules comparing to NP3 peptides. Binding capacities of G4A, G4S and G4T APL were slightly affected. G4F and G4Q showed decreased binding capacities by about 20% comparing NP3 epitope peptides. A7D, A7E, A7G, A7S and A7T APL retained the H-$2K^b$-binding capacity at the level of NP3 epitope peptides. A7F and A7P lost their binding capacities to H-$2K^b$ by 20-30% comparing NP3 peptides.
In order to identify antagonistic peptides for NP3-specific CTL clones, APL were tested whether they could inhibit cytotoxic activity of NP3-specific CD8+ CTL clones in the presence of NP3 epitope peptides. Of G4X peptides, negative-charged G4D and G4E APL were most effective for inhibition of CTL activities. Following them G4A, G4N, G4R and G4V APL showed 25% inhibition of CTL activities. G4F, G4P and G4Q APL showed CTL inhibition less than 8%. G4H, which retained nearly whole capacity to bind to MHC class I molecules, exhibited merely inhibitory effects, about 5% inhibition of NP3-specific CTL activities. In case of A7X, bulky/hydrophobic APL such as A7I, A7L and A7V inhibited cytotoxic activities most effectively. A7H APL also showed similar antagonistic responses as above, even if A7H is not bulky or hydrophobic.
There was some relationship between binding capacity and cytotoxicity inhibition. But antagonistic effects of APL were not solely dependent upon binding capacities to H-2Kb. They showed a pattern of dependency on possible binding sites to TCR, that is, the position of amino acids in an epitope peptide. Antagonistic APL blocked the in vitro restimulation of primary CTL blast cultures, which could be expanded antigen-specifically by antigen-pulsed APC. APL were also tested for their inhibitory properties in the early steps of signal transduction of T cell. TCR-down regulation was interfered by antagonistic APL. And NP3-APL blocked the phosphorylation of ZAP-70 protein tyrosine kinase in the presence of NP3 epitope peptides. Resultantly antagonistic peptides were identified and CD8+ CTL activities were modulated by those NP3-APL.'
세포독성 T 세포는 제1형 조작적합항원과 epitope peptide와의 결합체를 인지함으로써, T 세포 내의 적절한 신호전달 과정을 거쳐, 세포독성 활성을 획득 및 유지할 수 있다. 이러한 T 세포의 인지과정 중에서, T 세포수용체에 의한 epitope peptide의 인지가 세포독성 T 세포 활성에 가장 중요한 영향을 미치므로, epitope peptide의 아미노산 조성 및 서열이 바뀌면 T 세포 활성이 민감한 반응을 보일 것이다. CD8+ 세포독성 T 세포에 대한 antagonistic peptides를 확인하고 그 작용을 알아보기 위하여, 한탄바이러스 핵단백질 내의 epitope peptides를 확인하고 세포독성 T 세포 클론을 확립하여 이에 사용하였다. H-$2K^b$ 형의 peptides를 컴퓨터 프로그램을 이용하여 선정하였고, H-$2K^b$ 와의 결합 측정 및 한탄바이러스에 의해 C57BL/6 생쥐에서 유도된 세포독성 T 세포에 의한 세포독성 활성 측정을 통하여, 3 종류의 peptides(NP3, NP4, NP7)를 확인하였다. 리포좀-peptide를 이용한 면역원성 측정으로 NP3 및 NP4 peptide가 세포독성 활성을 유도함을 확인할 수 있었고, NP7 peptide는 H-$2K^b$ 결합부위를 Proline--->Tyrosine으로 치환한 경우에 약 50%의 세포독성 활성의 증가를 나타내었다. 즉 NP7 peptide는 제1형 조직적합항원에의 결합력이 약하여 생체 내에서의 세포독성T세포 유도가 효과적이지 못한 것으로 볼 수 있다.
Epitopes인 NP3, NP4 및 한탄바이러스를 면역원으로 하여 C57BL/6생쥐에서 세포독성T세포를 유도하고, 장기간 (6개월-1년)의 in vitro 재자극 및 제한희석 클로닝을 통하여 CD8+ 세포독성 T 세포클론을 확립하였다. 그 결과 NP3-면역 및 한탄바이러스-면역의 경우에 NP3-특이적인 세포독성 T 세포클론, 6 종류를 확립할 수 있었다. 이 들은 세포성장 및 세포독성활성 측면에서 장기간 배양하는 동안 안정성을 보였고, NP3-특이적이며, NP3-농도 의존적이며, Alanine-치환 NP3 peptides의 T 세포수용체에 의한 인지 정도 측정을 통하여, 전형적인 H-$2K^b$ 형의 T 세포 특성을 보여 주었다. 이들 세포독성 T 세포 클론의 표면에 발현되어 있는 CD 분자를 FACS로 분석한 결과 CD3+, CD4-, CD8+, CD25+, CD62L+, CD69+, NK1.1- 및 DX5- 이었고, T 세포수용체 Vb type은 모두 Vb6+이고, CDR3 부위의 염기서열은 GeneBank에 등록하였다.(Accession# AF07098)
세포독성T세포의 세포독성을 항원 특이적으로 조절을 할 수 있다면, 이는 매우 유용할 것이다. 이를 위해 NP3 유래의 아미노산 치환 peptide ligand (APL)을 34 종류 고안 및 합성하였고, 이 들의 H-2Kb-결합 능력 및 HT-NP3-1-1 세포독성 클론의 NP3- 특이적인 세포독성 활성저해 여부를 확인하였다. H-$2K^b$-결합 중요 부위로 잘 알려진 제5번 및 8번 아미노산은 그대로 두고, T 세포수용체와의 결합 중요부위로 보고되고 있는 제4번 및 7번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하여 APL을 합성하였기 때문에, APL의 H-2Kb-결합능력은 80% 이상 유지되고 있음을 알 수 있었다. 그러나 세포독성활성은 G4D, G4E 및 G4S 그리고 A7I 및 A7L-APL에 의해 30-40% 저해됨을 확인하였다. 또한 G4I, G4L 및 G4V 그리고 A7D 및 A7E-APL은 약 10% 정도의 세포독성활성의 증가를 나타내었는데, 이로부터 HT-NP3-1-1 세포독성세포 클론의 T세포수용체는 epitope peptide의 제4번 및 제7번 아미노산을 인지하는데 있어서, 이들 아미노산 잔기의 음이온, 공간적 크기 및 소수성 등에 매우 민감하게 반응을 보임을 알 수 있다. 다중치환-APL을 이용한 실험을 통하여 이들 antagonist-APL peptides의 세포독성저해 효과는 제4번 및 7번 위치에서 서로 부가적으로 일어나지는 않고, 어느 쪽에서든지 한 번 일어난 antagonistic 효과는 그 것으로 충분한 것으로 보인다. 이 들 antagonistic APL peptides는 in vitro에서의 epitope peptide에 의한 재자극 작용, T 세포수용체와 epitope peptide의 결합 후에 일어나는 T세포수용체의 세포 표면발현 저하현상 및 ZAP-70 효소의 인산화 현상을 저해하였다. 이상의 연구를 통하여 세포독성 T세포의 epitope peptide로부터 유래된 아미노산-치환 peptide ligands를 이용함으로써, 세포독성 T 세포의 세포독성활성을 조절할 수 있음을 알 수 있다. 이와 같은 연구 결과는 항원과 T 세포의 인지, T 세포수용체를 통하여 일어나는 T세포의 신호전달기작 연구, 보다 더 효과적인 백신 개발 및 항원 특이적인 세포면역기능의 조절을 통한 자가 면역질환의 연구 등에 기초적인 정보로 이용할 수 있을 것이다.
