Signal peptides of secretory proteins interact with various membrane and cytosolic components during the course of translocation. The primary aim of this study is to elucidate the interaction of signal peptides of ribose binding protein (RBP) with Escherichia coli (E.coli) signal recognition particle (SRP) composed of Ffh protein and 4.5S RNA, SecA and lipid bilayer. The signal peptides, as the nascent chain emerging from ribosome, are thought to bind the methionine-rich domain of Ffh. The structure of a peptide corresponding to one of the proposed methionine-rich segment of Ffh was determined using CD and NMR. This peptide was found to have a very unusual strong propensity to form alpha-helix and assumes an appreciable alpha-helix conformation even in water. The interactions of methionie-rich segment of the M-domain and M-domain as a whole with signal peptides were checked. It was reported that the only signal peptides of precursor proteins which are translocated inhibit the GTPase activity of E.coli SRP (Miller et al., 1994. Nature 367, 657-659). But, the signal peptides of revertant precursor RBPs, which show recovered capability of secretion, had no effect on the activity as is the case of nonfunctional mutant. Although functional signal peptides were previously reported to stimulate the ATPase activity of SecA in the presence of lipid vesicles, revertant and mutant signal peptides of RBP were found to inhibit it under various conditions. Comparison of the effect of revertant signal peptides with that of the wild type was possible only with the corresponding precursor protein due to low solubility of the wild-type peptide. The enhancement of SecA ATPase activity and reduction of ANS binding to SecA induced by the wild type precursor RBP were much more pronounced than by either mutant or revertant precursor RBPs. Revertant signal peptides assume predominantly α-helical conformations in the presence of anionic phospholipid vesicles and restrict the acyl chain motion of lipids, indicating the deep penetration of these peptides into the acyl chain region. On the other hand, the alpha-helical content of mutant signal peptide was only about half of that of revertant peptides and the extent of bilayer penetration appears also to be less than those of the revertants.
신호 서열은 단백질의 분비 과정 동안 여러 종류의 세포질 및 지질막 구성 요소들과 상호작용을 한다. 그래서, RBP (ribose binding protein) 단백질의 신호 서열들과 대장균의SRP (signal recognition particle; Ffh/4.5S RNA complex), SecA 및 지질 이중막 등과의 상호작용을 연구하여, 분비 과정의 메커니즘을 이해하기 위한 단서들을 얻고자 하였다. SRP를 이루는 단백질인 Ffh의 M domain에 속하는 methionine-rich segment가 리보좀에서 번역되어 나오는 신호 서열과 결합한다는 모델이 제시되었다. 이에 methionine-rich segment의 구조를 CD와 NMR 방법으로 연구하여, 이 부분에 해당하는 펩타이드는 물에서도 α-helix를 이룰 정도로 α-helix를 형성하려는 경향성이 높다는 사실을 밝혀 내었다. 그리고, CD와 crosslinking 및 fluorescence anisotropy 방법 등을 이용하여, 신호 서열들과 Ffh의 M-domain및 methionine-rich segment와의 상호 작용에 관한 연구를 수행하였다. 대장균의 SRP인 Ffh/4.5S RNA 복합체와 RBP의 신호 서열들과의 상호작용은 Ffh 단백질의 GTPase 활성을 이용하여 간접적인 방법으로 연구하였다. 예전에 보고된 바에 따르면 (Miller et al., 1994. Nature 367, 657-659), 단백질 분비를 가능하게 하는 신호 서열들만이 SRP의 GTPase 활성을 저해하였다. 그러나, 분비가 가능한 RBP의 복귀 돌연변이 신호 서열들은 전위가 불가능한 돌연변이 신호 서열들과 마찬가지로 대장균 SRP의 GTPase 활성에 별다른 영향을 미치지 못하였다. 분비가 가능한 신호 서열들은 지질 막의 존재 하에서 SecA의 ATPase 활성을 증가 시킨다. 그러나, RBP의 돌연변이 및 복귀 돌연변이 신호 서열들은 모두 여러 조건 하에서 SecA의 ATPase 활성을 저해하였다. RBP의 야생형 신호 서열은 물에 대한 용해도가 낮아서 실험에 사용할 수 없었기 때문에, 야생형 신호 서열과 복귀 돌연변이 신호 서열들과의 비교는 이에 해당하는 전구체 RBP 단백질들을 이용해서 연구하였다. 그 결과, SecA의 ATPase 활성과 ANS 결합 정도는 돌연변이나 복귀 돌연변이 신호 서열들보다 야생형 신호 서열을 가진 RBP 전구체를 넣어준 경우에 훨씬 더 두드러지게 증가하였다. RBP의 복귀 돌연변이 신호 서열들은 물에서는 random coil의 구조를 가지나, 음이온 인지질 성분이 들어간 지질 막이 존재하면 α-helix를 형성하였다. 또한, 이들은 지질 이중막의 안 쪽 부분에 위치한 acyl chain의 운동성을 크게 감소 시켰으며, 이는 복귀 돌연변이 신호 서열들이 이중막의 깊숙한 부분까지 삽입된다는 것을 의미하는 현상이다. 반면에, 지질 막 존재 하에서 돌연변이 신호 서열들이 형성하는 α-helix는 그 평균 양이 복귀 돌연변이 신호 서열들의 절반 정도 밖에 되지 않았으며, 지질 막에 대한 삽입 정도도 복귀 돌연변이 신호 서열들과 비교하면 상당히 미약하였다.
