Guamerin, a cysteine-rich protein from the Korean leech Hirudo nipponia, is a potent inhibitor of elastase. The guamerin encoding gene was obtained by polymerase chain reaction and expressed in Escherichia coli under the control of T7lac promoter by using a pET22b vector, which has a pelB leader sequence and a 6 X Histidine tag at the N-terminal and C-terminal regions, respectively. Recombinant guamerin was purified using His●Bind affinity column and reverse-phase high pressure liquid chromatography. N-terminal amino acid sequence analysis, compostion analysis and electrospray ionization mass spectrometry confirmed that recombinant guamerin had correctly processed N-terminus, expected amino acid sequence and molecular mass. The activity of recombinat guamerin was very similar to that of native protein. Double reciprocal plotting showed that the recombinant guamerin had inhibition constant of $8.8\times10^{-9}$ M against elastase, which is comparable to native guamerin. Recombinant guamerin formed a protease-inhibitor complex which was demonstrated by gel permeation chromatography. The recombinant guamerin may provide a useful tool for the evaluation of the elastase inhibitory mechanism and for treating various inflammatory human diseases.
거머린(guamerin)은 한국산 거머리(Hirudo nipponia)에서 분리된 단백질 분해효소 억제제로서 일라스타제(elastase)와 카이모트립신(chymotrypsin)을 강하게 억제하며 10 개의 시스테인이 포함된 57개의 아미노산으로 구성되어 있다.
거머린은 거머리내에서 극히 제한적인 양이 존재함으로 인해, 거머린의 구조와 일라스테즈와 관련된 질병을 연구하는데 있어 제한이 따른다. 그러므로 활성이 있는 재조합 거머린을 유전공학적 방법으로 얻을 수 있는 방법의 개발이 필수적이었다.
발현은 대장균의 periplasm으로 재조합 거머린이 분비되도록 디자인된 벡터(pET22b)를 이용하였는데, 이는 cytoplasm 보다는 periplasm이 좀 더 oxidizing condition이어서, 5개의 이황화 결합이 좀 더 잘 일어날 것이라고 예상하였기 때문이다.
대장균내에서 재조합 거머린의 분리는 $Ni^{2+}$ 친화컬럼과, 역상 HPLC를 통해 순수분리하였으며, 생산 수율은 1.2 mg/l 였다. 재조합 거머린이 periplasm으로 분비된 후 대장균의 signal peptidase에 의해, N-terminal의 signal peptide가 제대로 processing되고, DNA 서열을 통해 예상하고 있는 아미노산 서열을 재조합 거머린이 가지고 있는지는 57개의 아미노산 서열과, ESI-MS 그리고 아미노산 성분 분석을 통해 확인하였다.
Periplasm으로 분비된 재조합 거머린의 억제상수($K_i$)는 일라스테즈에 대해 8.8 nM, 카이모트립신에 대해서는 3.2 nM 이었다. 이는 native 거머린의 억제 활성도와 거의 일치하는 것이었다.
그러므로 활성있는 재조합 거머린의 발현은 대장균내에서 periplasm으로 분비될 때, 억제 활성도를 가지게 되며, 또한 재조합 거머린은 기능적, 구조적으로 native 거머린과 매우 유사함을 확인할 수 있었다.
