Mammalian DNA viruses often utilize components of the host cellular DNA replication machinery to carry out replication of their genomes. Thus, these viruses can be used as tools for characterizing factors involved in cellular DNA replication. To identify cellular factors that participate in viral DNA replication, we performed a two-hybrid assay in the yeast Saccharomyces cerevisiae with El protein as bait. Using this assay, we isolated Inil/hSNF55, a component of SWI/SNF complex, which facilitates transcription by altering the structure of chromatin6. In vitro binding and immunoprecipitation assays confirmed that El interacts directly with Inil/hSNF5. Transient DNA replication assays revealed that HPV DNA replication is stimulated in a dose-dependent manner by the addition of lnil/hSNF5 and that Inil/hSNF5 antisense RNA blocks HPV DNA replication. Amino acid substitutions at residues conserved among the various El proteins abolished El-Ini1lhSNF5 interaction and reduced HPV DNA replication in vivo. These data suggest that InillhSNF5 is required for efficient replication of papillomavirus DNA and thereby imply the involvement of Inil/hSNF5 (either alone or in the SWI-SNF complex) in mammalian DNA replication.
The SWI/SNF complex facilitates transcription by altering the structure of chromatin. Inil/hSNF5, a component of hSWI/SNF complex, has been involved in modulation of chromatin structure. Inil/hSNF5 binds DNA nonspecifically and regulates DNA replication through protein-protein interactions with viral replicator El. Using GST pulldown assay and two-hybrid assay in yeast and mammal, we found that E2 also could bind to hSNF5 with El and E2 per se associated with hSNF5. We also showed that E2 proteins from low-risk and high-risk group of human papillomaviruses bind to hSNF5 in vitro. Detailed analysis of E2 binding domain for hSNF5 demonstrated that E2 binds to the conserved region III of hSNF5 distinct to El binding region. Overexpression of Inil/hSNF5 modulated E2-dependent transcription by E2 and ectopic expression of antisense hSNF5 RNA showed repression of E2-dependent transcriptional activation, indicating that hSNF5 is a modulator of the E2 activation domain. In addition, the transcription defective mutants within amphipathic helices motif of E2 did not bind to hSNF5. Our data suggest that hSNF5 either alone or in the SWI/SNF complex can be involved in not only viral DNA replication but also viral transcription via protein-protein interaction.
CREB Binding Protein (CBP) is a coactivator containing multiple regions of protein-protein interactions with different transcription factors, components of the basal transcriptional apparatus, and other coactivator proteins. We report here that CBP is also a coactivator of the human papillomavirus E2 protein, which is a sequence specific transcription/replication factor. We provide biochemical, genetic, and functional evidences that CBP directly contacts human papillomavirus E2. Adenovirus E1A represses E2-dependent transcriptional activation whereas the mutant E1A that is defective in interaction with p300/CBP shows little effect on E2-depedent transcription. Antisense CBP decreases E2-dependent transcription, suggesting that endogenous CBP is required for optimal E2 dependent transcription. Surprisingly, p300 that is a homolog of CBP represses E2-dependent transcription. We show that repression of E2-dependent transcription by p300 can be relieved by adding CBP. Mutations of amphipathic helices motifs within HPV-18 E2 abolishes transcriptional activation properties and binding of CBP to E2 is necessary for E2-dependent transcription. We also showed that CBP stimulated papillomavirus DNA replication. From these results, we suggest that a simple competition between CBP and p300 provides the variety of transcriptional regulation in viral replication/transcripton factor E2. And, we conclude that some proteins involving in chromatin remodeling and modification can be contributed to papillomavirus DNA replication.
진핵세포의 DNA 복제를 연구함에 있어서 파필로마바이러스는 전형적인 모델로서 제안되고 있다. 우리는 진핵세포의 복제에 중요하고 이에 관여하는 숙주 단백질에 관한 정보를 얻기 위하여 Yeast two hybrid를 이용한 실험을 수행하였다. 실험을 통해서 E1과 결합하는 Ini1/hSNF5라는 숙주 단백질을 찾아내었다. 이 단백질은 Chromatin remodeling에 관여하는 SWI/SNF 복합체의 한 구성요소로서 작용하며 최근에 HIV Integrase와 결합하여 HIV가 숙주 게놈내로 삽입되는 과정을 촉진한다는 사실이 보고되었다. 우리는 유전학적 방법과 생화학적 방법을 이용하여 E1과 Ini1/hSNF5가 특이적으로 결합하며 그 결합 위치도 결정하였다. 또한, 생체내 DNA 복제 실험을 통해 Ini1/hSNF5가 파필로마바이러스의 복제에 기여함을 밝혔다. 또한, 돌연변이 E1을 이용한 실험을 통해 Ini1/hSNF5에 물리적인 결합능력이 감소한 돌연변이체는 DNA 복제 능력도 현저히 감소함을 확인하였다. 본 실험도중에 E2 단백질 또한 hSNF5와 결합한다는 사실을 시험관외에서 알아낼 수 있었다. 더 자세한 정보를 얻기 위해서 생화학적인 실험을 통해 E1과 상이한 위치에서 hSNF5와 E2가 결합한다는 사실을 밝혀낼 수 있었다. 이 사실로 미루어 보아 E2 의존성 전사에 hSNF5가 관여하리라 예상할 수 있었고 실제로 hSNF5의 의한 전사 촉진을 확인할 수 있었다. Antisense hSNF5 RNA 발현은 E2 의존성 전사를 감소시켰다. 이로 미루어 보아 숙주 세포내 존재하는 hSNF5가 E2 의존성 전사에 매우 중요함을 관찰 할 수 있었다. 또한, 지금까지 잘 알려진 E2 돌연변이체를 골라서 E2와의 결합 실험을 수행해 본 결과 E2 의존성 전사가 불가능한 돌연변이체는 hSNF5와의 결합도 불가능함을 알 수 있었다. 이로 미루어보아 hSNF5는 파필로마바이러스 DNA복제 뿐만 아니라 파필로마바이러스 전사에도 매우 중요함을 알 수 있었다.
이러한 실험 결과를 토대로 우리는 Chromatin remodeling에 관여하는 또 다른 단백질인 co-activator CBP와 파필로마바이러스 단백질간의 상호 Cross-Talk을 조사해보았다. E2와 CBP는 생화학적 방법, 유전학적 방법을 이용한 결합실험에서 직접적으로 결합가능함을 확인할 수 있었다. 또한, E2는 CREB이 결합한다고 알려진 CBP내 KIX 도메인에 결합하며 대부분의 파필로마 바이러스는 이 KIX 도메인과 상호작용할 수 있었다. Gel retardation 실험을 통해 CBP가 E2의 결합능력을 현저히 상승시킨다는 사실을 알 수 있었다. 따라서, CBP 또한 파필로마바이러스 E2 단백질의 전사능을 촉진하리라 예상할 수 있었다. 예상대로 CBP는 E2 의존성 전사를 촉진하였고 CBP의 저해작용을 하는 분자인 아데노바이러스 E1A에 의해서 전사가 억제되었다. 또한, Antisense CBP RNA에 의한 실험을 통해 숙주내 CBP가 E2 의존성 전사에 관여한다는 사실을 알 수 있었다.
CBP의 homolog인 p300도 또한 CBP와 마찬가지로 co-activator 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, p300도 CBP와 마찬가지로 동일한 역할을 할 수 있는 지를 조사해 보았다. 놀랍게도 p300은 CBP와는 달리 E2 의존성 전사를 억제하였고 억제된 E2 의존성 전사는 CBP에 의해서 다시 상승된다는 사실을 알 수 있었다. 따라서, E2 의존성 전사에 있어서 CBP는 co-activator로서 작용하며, p300은 co-repressor로서 작용한다는 사실을 밝혀내었다. 전사에 문제가 있는 E2 돌연변이체가 CBP와의 결합에 있어서 어떤 상황을 연출하는 지를 알아보기 위해서 유전학적 방법과 생화학적 방법을 이용하여 조사해 본 결과 E2 돌연변이체는 CBP와의 결합능력이 현저히 감소하고 있다는 사실을 알 수 있었다. 그러나, 이들 결합능과 별도로 현저히 낮은 전사 능력을 발휘함을 미루어 보아 CBP 결합이 E2 의존성 전사에 필요하나 충분한 것은 아니라고 생각되었다.
CBP가 E2의 DNA 결합능을 향상 시키는 것으로 미루어 CBP가 파필로마바이러스 DNA 복제를 촉진할 수 있다는 사실을 가정할 수 있었다. 실험 결과, CBP는 파필로마바이러스 DNA 복제를 촉진하였으나 histone acetyltransferase가 망가진 CBP도 또한 파필로마바이러스 DNA 복제를 촉진하였다.
결국, CBP 또한 Ini1/hSNF5 와 마찬가지로 파필로마바이러스 DNA 복제를 촉진하였으며 전사에 관여하는 요소중 특히 chromatin remodeling에 관여하는 단백질들은 파필로마바이러스 DNA 복제에 직접적으로 관여한다는 사실을 알 수 있었다.
