In vivo excision and amplification of pre-determined, large genomic segments, directly from the genome of a natural host, provides an alternative to conventional cloning in foreign vectors. The prototype of our approach was the excisional replication of some viruses such as the lambda lysogen. A similar machinery was used to excise and amplify large genomic segments from the original organisms. This approach involved the insertion of two recognition sequences, loxPs, for the site-specific recombinase, Cre, into the genome at pre-determined sites, 50-100 kb apart. The integration of these sequences, together with a conditional replication origin (ori), was targeted by homologous recombination. The strain carrying the insertions was stably maintained until, upon induction of specifically engineered genes, the host cell expressed the site-specific recombinase and an ori-specific replication protein. The recombinase then excised and circularized the genomic segment flanked by the two loxP sites. This excised and circularized DNA, which contained the ori sequence, was amplified with the aid of the replication protein and could be isolated as large plasmids.
We have devised three in vivo procedures for excising large segments of Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae and human genome using bacteriophage P1 Cre/loxP system. For amplification of the excised circular DNAs, E. coli R6K plasmid-derived π/γ-ori replication system, yeast 2 ㎛ plasmid-derived Flp/FRT/2 ㎛-ori system, and Epstein-Barr virus-derived EBNA1/oriP or Simian Virus 40-derived large T antigen/SV40-ori replication machinery were used, respectively. Applying these procedures, the 50-kb and 100-kb DNA segments of E. coli, S. cerevisiae and human genomes were successfully excised and in vivo amplified by the amplification functions. Such excised and amplified genomic DNA segments can be used for the sequencing the genome and functional analysis of any genes of each organism.
위치특이적 재조합 효소계인 Cre/loxP system을 이용하여 돌연변이를 최소화하면서 자체세포 내에서 거대 게놈 DNA의 특정부분 (50-100 kb)을 대량 증폭하여 분리하는 방법을 개발하였다. 본 연구는 Cre recombinase의 인식부위인 loxP site 두 개를 genome 상에 서로 50-100 kb 정도 떨어진 위치에 삽입시킨 후, Cre에 의하여 50-100 kb의 DNA fragment를 genome으로부터 원형의 형태로 떨어져 나오게 하고 이것을 loxP site와 함께 삽입된 origin of replication (ori)를 이용하여 대량 복제하는 것이다. 본 연구에서는 특정부분의 게놈 DNA를 자체세포 내에서 직접 절단하여 증폭할 수 있는지를 Escherichia coli, yeast 그리고 human cell을 이용하여 시도하였다.
E. coli에서는 게놈 DNA의 절단에 Cre/loxP system을, 절단된 DNA의 증폭에 E. coli plasmid R6K에서 유래한 π/γ-ori replication initiation system을 사용하였다. 본 방법을 이용하여 E. coli genome의 50-kb trg-narZ와 100-kb trg-hipA region의 증폭 분리하였다. Yeast Saccharomyces cerevisiae에서는 Cre/loxP system과 함께 DNA의 증폭에 2㎛ plasmid에서 유래한 Flp/FRT/2㎛-ori system을 이용하여 S. cerevisiae chromosome III의 50-kb LEU2-YCR011c 와 100-kb LEU2-YCR035c region을 증폭 분리하였다. Human cell에서는 Cre/loxP system과 Epstein-Barr virus에서 유래한 EBNA1/oriP replication system을 이용하여 human chromosome 17에 위치한 40 kb의 inducible nitric oxide synthase gene의 증폭 분리를 확인하였다.
본 연구로부터 Cre/loxP system에 의한 거대 genome의 위치 특이적인 절단과 이의 대량 증폭방법을 prokaryotic cell (E. coli) 뿐만이 아니라 eukaryotic cell (S. cerevisiae, human cell)에서도 적용 가능함을 알 수 있었으며, DNA의 증폭 및 분리가 자신의 세포 내에서 진행되므로 현재 일반적인 DNA cloning 방법에서 나타날 수 있는 DNA deletion, rearrangement, mutation, copying fidelity 그리고 sequence gap 등의 문제점등을 극복할 수 있을 것이며 거대 유전체 DNA의 functional analysis에도 응용할 수 있을 것이다.
