Blood-sucking leeches are known to have various anticoagulant peptides that are necessary to prevent the clotting of blood during ingestion and digestion. The Korean native leech, Hirudo nipponia also has potent antithrombins and antiplatelet agents in the saliva. The internal amino acid sequence of the thrombin inhibitor secreted by H. nipponia into saliva is unexpectedly different (55%) from that of hirudin secreted by H. medicinalis. This difference in sequence is reflected in the lack of neutralization by the polyclonal antibody to hirudin from H. medicinalis. Blockage of the N-terminal in antithrombin from H. nipponia appears to be a further real difference compared to hirudin from H. medicinalis.
A new thrombin-specific inhibitor, named hirujin, was purified from H. nipponia by size-exclusion, ion-exchange, affinity and high performance liquid chromatography. The molecular mass obtained by mass spectrometry was 7020 Da, which was less than the estimate from gel electrophoresis (= 10 kDa). Hirujin is an acidic inhibitor (pI = 3.8) and it is very stable in heat, pH, and chemical denaturants. The binding of hirujin to thrombin is extremely tight with a low inhibition constant, Ki value of 148 fM. Fifty amino acid residues of the C-terminal region of hiruin were determined, and estimated 10 residues of the N-terminal sequence were not determined due to blockage at the N-terminus. The sequenced N-terminal region showed a similarity to the same region of the hirudin sequence, but no matches were found in the C-terminal regions of hirudin and hirujin. The new inhibitor has an O-glycosylated serine residue in front of three consecutive proline residues in the C-terminal domain. Hirujin and its variant form a new subfamily within hirudin family.
A cysteine-rich (approximately 20%), low molecular mass (MW 6 kDa) polypeptide has been isolated from Hirudo nipponia. From its amino acid composition and N-terminal amino acid sequence analysis, the new protein is similar to granulin (or epithelin), and so it has been named leech granulin. The leech granulin behaved as a thrombin inhibitor in the purification steps of size exclusion, ion exchange, chromatofocusing, and reversed-phase HPLC. The leech granulin is an acidic peptide (pI = 3.75) containing high cysteine residues with a unique sequence similar to granulins or epithelins isolated from other organisms. For the first time, a granulin-like polypeptide having thrombin inhibitory activity has been isolated from a leech species.'
흡혈거머리의 침샘 단백질 중에는 숙주의 혈액응고 기작을 극복할 수 있는 여러 종류의 단백질이 포함되어있으며, 히루딘이 그 가장 좋은 예이다. 우리나라의 토착 거머리인 Hirudo nipponia 도 이러한 숙주 혈액응고 기작을 막는 항 혈액응고 성분 및 항 혈소판 응집 성분을 갖고 있기 때문에, 사람이 거머리에게 물렸을 때 흘러나온 피는 그 즉시 응고되지 않으며, 또한 물린 상처에서는 긴 시간동안 피가 흘러나오게 된다. 거머리에 의해 물린 상처에서 피가 흘러나오는 시간은 유사한 상처에서 피가 흘러나오는 시간에 대해 35 배정도 오랜 시간이 걸리며, 혈액 응고 실험의 결과, 상처에서 약 15분 기간 동안 흘러나오는 피에 항 트롬빈 성분이 존재한다는 사실을 알 수 있었다. 혈소판의 응집 반응은 이 기간동안 트롬빈이나 ADP 등에 의해 유발되었다. 콜라젠에 의한 혈소판 응집은 강하게 억제가 되었는데, 이는 콜라젠과 혈소판의 상호작용을 막는 성분을 거머리가 침 속에 갖고 있다는 것을 간접적으로 보여준다.
혈액응고의 억제는 주로 거머리 침 속에 존재하는 항트롬빈 성분에 의한 것임을 확인하고, 혈액응고를 막는 성분을 침샘에서 분리해낸 결과, 분리된 트롬빈 억제제의 아미노 말단기가 막혀있어 아미노산 서열분석을 할 수 없었다. 단백질 분해효소인 트립신으로 이 억제제를 처리한 후 그 펩티드 단편의 아미노산 서열을 분석해보았을 때, 29개의 아미노산 서열이 밝혀졌으며, 이 서열은 히루딘의 서열과 높은 유사성을 보였다.
이 트롬빈 억제제의 아미노산 서열과 그 특성을 분석하기 위해, 거머리 전체에서 다량의 억제제를 겔 크로마토그래피와 이온교환 크로마토그래피, 트롬빈 친화 크로마토그래피 및 역상 HPLC 방법으로 분리하였다. PAGE 상으로 10 kDa 의 질량을 갖는 것으로 나타난 트롬빈 억제제는 질량 분석 스펙트럼방법으로 억제제의 질량을 측정한 결과 7020 Da 으로 밝혀졌다. 히루진으로 명명된 이 단백질의 pI 값은 3.8이고 열과 낮은 pH, denaturant 에 대해 높은 안정성을 갖고 있었다. 트롬빈에 대한 히루진의 결합은 낮은 억제상수 (Ki = 148 fM) 를 갖는, 강한 상호작용을 수반하는 결합으로 나타났다. 아미노 말단기의 변형으로 약 10여개의 아미노 말단을 제외한 내부 아미노산 서열을 밝혀내었는데, 이 중 아미노말단 영역의 아미노산 서열이 히루딘과 유사하다는 것을 알아낼 수 있었다. 그러나 카르복시 말단 부위의 서열에 있어서는 히루딘과 히루진은 전혀 다른 양상을 보였다. 또한 이 억제제는 카르복시 말단 부위의 세개의 프롤린 (Pro) 이 연속하여 존재하는 서열 바로 앞에 위치한 세린(Ser)에 O-glycosylation 형태의 육탄당의 탄수화물기가 붙어있는 당단백질임을 밝혀내었다. 계통학적인 분석에 의하면 히루진(hirujin A)과 또 하나의 분리된 히루진 변이체(hirujin B)는 히루딘 그룹내에서 다른 히루딘 변이체들과는 다른 새로운 그룹으로 분류가 될 수 있음을 알 수 있었다.
우리나라 토착 흡혈 거머리인 H. nipponia 로부터 트롬빈 억제제를 분리하는 과정에서 트롬빈 억제활성을 갖는 새로운 단백질이 발견이 되었다. 이 단백질은 시스테인이 높은 비율로 포함되어 있으며 (약 20%), 분자량도 작은 (6 kDa) 특성을 갖고 있었다. 아미노산 조성분석과 아미노산 서열의 분석을 통해, 이 단백질은 다른 연구자들에 의해 포유류와 어류 및 다양한 종에서 분리가 된 granulin (혹은 epithelin)과 유사한 아미노산 구조를 갖고 있어 leech granulin 으로 명명하였다. Granulin 은 거머리에서는 처음으로 발견되었으며 현재, 세포의 성장을 촉진하거나 혹은 억제하는 기능을 갖고 있는 세포 성장 조절 인자로 연구되고 있는 단백질이다. 거머리에서 분리된 leech granulin은 겔 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 크로마토포커싱, 역상 HPLC 방법으로 분리하는 동안 트롬빈 억제활성을 계속해서 갖고 있음이 밝혀졌고, 아미노산 서열이 여타 granulin 의 특이적 서열 형태와 일치하고 있었다. 다른 granulin의 구조가 최근 액체상에서 밝혀졌는데, 그 구조는 작은 크기의 단백질 분해효소 억제제나 EGF 같은 세포성장 조절인자와 유사한 antiparellel beta-sheet 구조가 겹쳐있는 모양을 하고 있다. 이 단백질은 역시 앞의 히루진과 같이 낮은 pI 값(3.75)을 갖고 있었으며, 이러한 성질은 아스팔틱산(Asp)같은 산성 아미노산이 상대적으로 높은 비율로 함유되어 있기 때문에 나타나는 것으로 보여지며, 산성을 띠는 서열상의 특정부위는 트롬빈의 Exosite와 상호작용을 함으로써 트롬빈의 활성을 억제하는 것으로 예측되어진다. 최근 트롬빈은 단백질 분해효소의 기능만이 아닌 세포의 성장을 조절하는 인자로서의 기능을 수행한다는 연구결과가 나오는 것으로 볼 때, granulin은 직접적으로 세포막에 존재하는 수용체와 결합을 함으로써도 세포의 성장을 조절할 뿐만 아니라, 트롬빈과 같은 세포성장에 관여하는 단백질 분해효소 억제제의 활성을 조절함으로써도 세포 성장에 관여를 하는 것으로 보여진다.
