D-Hydantoinase is a multimeric enzyme that is active and stable in dimer form but easily deactivated when it is dissociated into monomers. Many multimeric enzymes and proteins undergo unstable monomer stage in the deactivation. D-Hydantoinase was crosslinked into dimer by EDC (1-Ethyl-3-(3-Dimenthylaminopropyl) carbodiimide Hydrochloride) to investigate if these multimeric enzymes could be stabilized by solidification of their multimeric structure with crosslinker. The cross-linked D-hydantoinase was decreased a little activity but showed remarkable improvement in stability to Heat, low pH and organic solvent. Cross-linked D-hydantoinase was not neary inactivated at 70℃ for 30 minutes and exhibited 60% of initial activity at 55℃ in 25 hours but native enzyme lost 40% of initial activity at 55℃ for 30 minutes. Moreover, 50% of native enzyme was deactivated at 50 mM phosphate buffer, pH 6.0 in 1 hour but 80% of crosslinked enzyme was active in same condition. In order to increase solubility of substrate including HPH (Hydroxyphenyl Hydantoin), organic solvent was added to reaction mixture. HPH was solved in reaction solution containing 20% methanol about three folds larger amount than in the solution without methanol. Furthermore, the cross-linked D-hydantoinase was very stable in the present of 20% methanol. Only 20% of the enzyme was deactivated at 55℃ for 4 hours in reaction mixture with 20% methanol but only 26% of native enzyme was active at same condition. WhenHPH and Hydantoin among substrates were converted for about 15 hours, N-carbamoyl D-amino acid of the product was generated by more 56% with cross-linked enzyme than with native enzyme.
D-Hydantoinase는 homo-dimer로 존재할 때는 활성이 높고 안정하지만 monomer로 분리되면 불안정하여쉽게 활성을 잃는다. 다른 많은 multimeric 효소들도 활성을 잃는 과정에서 이와 같이 불안정한 monomer 단계를 거치는 경우가 많다. 이런 multimeric 효소들을 crosslinking에 의해 quaternary structure를 고정화 시킴으로써 안정성을 증진시킬 수 있는지 알아 보기 위해, EDC (1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)carbodiimide, Hydrochloride)를 이용해 D-hydantoniase의 subunite들을 서로 crosslining시켰다. Crosslinking된 D-hydantoinase는 활성이 20% 정도 감소했지만 고온과 낮은 pH, 그리고 유기용매에 대한 안정성이 매우 증가하였다. 본래의 D-hydantoinase는 55℃에서 30분만에 초기 활성의 40℃를 잃어 버렸지만 crosslinking된 D-hydantoinase는 55℃ 에서 25시간이 지나도 60%의 활성이 남아 있었고 70℃ 에서도 30분간 방치하여도 활성에 거의 차이가 없었다. 낮은 pH에서의 안정성을 알아 보기 위해 phosphate buffer, pH 6.0에서 1시간 동안 방치하였을때 역시, 본래의 D-hydantoinase는 50%의 활성이 감소하였지만 crosslinking된 D-hydantoinase는 80%의 활성을 보였다. HPH (hydroxylphenyl hydantoin)을 포함한 기질의 낮은 용해도는 공정상에서 가장 큰 문제점 중의 하나이다. 이런 기질의 용해도를 증가시키시 위하여 organic solvent를 이용할 수 있는데, 반응 용액에 20%의 메탄올을 첨가하였을때 HPH의 용해도는 3g/l에서 8g/l로 증가하였고, 이런 기질농도의 증가는 반응속도를 2배 정도 증가시키는 효과를 보였다. 이렇게 20%의 메탄올이 첨가된 반응용액에서 본래의 D-hydantoinase는 55℃에서 4시간이 지나면 초기 활성의 80%를 잃어 버릴 정도로 심각하게 비활성화 되었지만 crosslinking된 D-hydantoinase는 같은 조건에서 26%의 활성만이 감소하였다. 이런 crosslinking에 의한 안정성의 증가로 HPH와 hydantoin 기질 용액을 각각 15시간 동안 반응시켰을 때, crosslinking된 D-hydantoinase에 의해 각각 58%와 56% 더 많은 생성물을 얻을 수 있었다.
