Cephalosporin-C (CPC) deacetylase [EC 3.1.1.41] (CAH; systemic name, cephalosporin-C acetylhy-drolase) plays a role in deacetylation of C-3 of CPC antibiotics. In this study we obtained the various lipase secreting microorganism by using a tributyrin agar plate method. Visible clear zones due to lipase microorganism, Pseudomonas, having the activity of CPC deacetylase by means of thin layer chromatography (TLC). Supernatants of candidate bacteria culture were reacted with cephalosporin-C and then spotted cellulose plate and was developed with mixture of isopropanol and water (ratio 7 to 3). The CPC deacetylase gene was cloned in E.coli JM109 and sequenced. The cloned DNA(pUCLip) was 2.6kb in length. The nucleotide sequence revealed the presence of one major open reading frame of 1905 nucleotides and encoded a polypeptide consisting of 634 amino acids. The initiation codon of cephalosporin-C deacetylase gene was ATG. The G+C content of the enzyme was 62%. The deduced amino acid sequence showed 58% identity to EstA of Pseuomonas aeruginosa. The consensus sequence maintained among other microorganism cephalosporin-C deacetylases, Gly-X-Ser-X-Gly, was not observed in this protein. Instead cephalosporin-C deacetylase contained the common sequence Gly-Asp-Ser-Leu found in the GDSL family of lipolytic enzymes.
Cephalosporin-C (CPC)는 C-7 위치뿐만아니라 C-3 위치에서의 치환도 가능하기 때문에 페니실린보다 훨씬 다양한 반합성 항생물질을 개발하는 것이 가능하다. 세팔로스포린-C 디아세틸라아제는 세팔로스포린의 C-3 위치를 탈아세틸화하는 기능이 있다. 본 연구는 국내토양에서 채취한 미생물들로부터 세팔로스포린-C 디아세틸라아제를 생산하는 균주를 선발하였다. 미생물 동정결과 Pseudomonas sp.로 밝혀졌고 이 균주로부터 세팔로스포린-C 디아세틸라아제를 E.coli MC1061에서 클로닝하였다. 이 유전자를 분석한 결과 1개의 open reading frame이 존재하고 있음을 발견하였으며, 1905개의 염기쌍으로 구성되어 있었다. CpcE 유전자는 634개의 아미노산으로 구성된 세팔로스포린-C 디아세틸라아제를 coding하고 있었다. 이 유전자는 ATG를 개시 codon으로 사용하고, 24개의 마미노산이 N-말단에 신호서열로 작용하는 것으로 보여진다.
CpcE는 기존의 다른 세팔로스포린-C 디아세틸라아제와 리파이제의 consensus sequence인 Gly-X-Ser-X-Gly을 포함하는 부위를 갖고 있지 않았으며, 대신 Gly-Asp-Ser-Leu이라는 리파아제의 새로운 GDSL family에서 관찰되는 아미노산 서열을 갖고 있는 것으로 관찰되었다. GDSL 서열은 N-말단에 근접해 있으며 이 서열의 serine 아미노산이 활성부위에서 작용할것으로 추정된다.
