The light chain fragment of botulinum neurotoxin, serotype A and serotype E, has been cloned to pET21-a using PCR amplification from chromosomal DNA and successfully expressed in E. coli strain. The expressed recombinant light chains were purified using His-bind resin which can bind to histidine tagged sequence conjugated expressed light chain. The zinc-endopeptidase activity and substrate specificity for SNAP 25 of constructed recombinant light chain of BoNT/A and BoNT/E was characterized. The cleavage activity was efficiently antagonized by chelating agent, ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA).
Distribution of SNAP 25, a target protein of botulinum type A and type E, in neuronal tissues and different nonneuronal tissues was studied using immuno blot analysis. The SNAP 25 was strongly expressed in brain, but little expression was observed in other tissues. In contrast, the SNAP 23, a homolog of SNAP 25, was not expressed in the brain, but strongly expressed in almost all other tissues examined. The results were supported by RT-PCR technique using SNAP 23 primers. In the conclusion, SNAP 23 may play a critical role in the process of membrane fusion in the constitutives pathway instead of SNAP 25. To develop the vaccine against botulinum toxin, Balb/C mice were vaccinated with the cell lysate expressing the light chain of botulinum type A, type B, and type E. The vaccination with crude recombinant L chain led to protection against a dose of up to $10^4$ $LD_50$ of type B botulinum toxin and $10^5$ $LD_50$ of the type A botulinum and $10^4$ $LD_50$ of type E botulinum. From this result, in the vaccination, the purified light chain might be useful for antigen.
본 실험에서는 보튜리눔 type A와 type E 신경 독소의 light chain이 PCR 기법을 이용하여 cloning이 되었고, E. coli에서 발현된 후 His-bind resin을 이용하여 성공적으로 정제되었다. 우선, 이 재조합 light chain의 zinc-endopeptidase activity와 SNAP 25에 대한 기질 특이성이 조사되었고, 이 효율적인 기질의 절단 능력이 chelating agent인 EDTA에 의해 저해되었다. 다음으로, 보튜리눔 type A와 type E의 기질 target protein인 SNAP 25의 신경조직 또는 비신경조직 내의 존재여부를 보기위하여 immunoblot analysis가 수행되었다. SNAP 25는 기존에 보고된 바와 같이 brain에 특이적으로 발현이 되고 있었고, 반면 SNAP 23은 신경조직에는 전혀 발현이 되고 있지 않았다. 반면 RT-PCR을 이용하여 조사된 비신경조직에서는 발현이 되고 있음을 확인 하였다. 따라서, 비신경세포의 exocytosis에서 이 SNAP 23이 SNAP 25 대신작용을 하고 있을지 모른다.
보튜리눔의 백신을 개발하기 위하여 우선 이들 light chain을 발현 하고 있는 cell lysate로 주기적으로 Balb/C 마우스에 면역 시킨 결과, type B는 104 LD50, type A는 105 LD50, type E는 104 LD50까지 방어효과가 있어, 이들 정제된 light chain으로도 백신으로 사용될 가능성이 있다.
