서지주요정보
Mutational studies in Korean patients with Wilson disease and the expression and transcriptional regulation of the ATP7B gene = 한국인에서 발견된 윌슨씨병을 유발하는 돌연변이와 그 유전자 (ATP7B)의 발현 및 발현조절에 관한 연구
서명 / 저자 Mutational studies in Korean patients with Wilson disease and the expression and transcriptional regulation of the ATP7B gene = 한국인에서 발견된 윌슨씨병을 유발하는 돌연변이와 그 유전자 (ATP7B)의 발현 및 발현조절에 관한 연구 / Eun-Kyung Kim.
저자명 Kim, Eun-Kyung ; 김은경
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 1999].
Online Access 원문보기 원문인쇄

소장정보

등록번호

8010038

소장위치/청구기호

학술문화관(문화관) 보존서고

DBS 99003

SMS전송

도서상태

이용가능

대출가능

반납예정일

초록정보

Wilson disease (WD) is an autosomal recessive disorder of copper transport. Its general characteristics are defective biliary excretion of copper and impairment in the incorporation of copper in ceruloplasmin. The product of the WD gene is a copper-transporting P-type ATPase (ATP7B). The ATP7B gene has 21 exons and encodes a protein of 1,465 amino acids. WD occurs once in 30,000-100,000 in most populations, but its exact incidence has not yet been determined in Korea. To identify mutations in Korean patients with WD, single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis followed by DNA sequencing of PCR amplified exons was performed. Of the 12 sequence changes identified in the ATP7B gene, three mutations (A874V, L1083F, and 2304delC) were novel causing WD. Arg778Leu, the most frequently reported mutation of this enzyme, was found in one of three unrelated patients studied. The novel single nucleotide deletion, 2304delC, was found in one patient. Since a mutation at cDNA nucleotide 2302 (2302insC) had been previously described, this region of the ATP7B gene may be susceptible to gene rearrangements causing Wilson disease. Among these WD patients, six new sequence polymorphisms (3244-5C→T, 1948-4C→T, 1870-2delA, Val864Ile, Val1109Met, and Leu770Leu) and two previously described (Lys832Arg and Val1140Ala) were also identified. To investigate the function of the ATP7B protein, the 4.5 kb full-length cDNA of the ATP7B gene encoding a protein of 1,465 amino acids was cloned. During the cloning of the ATP7B gene, the exon 6-7 and 6-7-8 deletion forms were detected in a human adult liver cDNA and fetal liver library, respectively. The each form was designated A△6-7 and F△6-8. Moreover, five alternative-spliced forms were also found by RT-PCR in HepG2 cells. The exon 8, exon 5-6-7, and exon 5-6-7-8 deletion forms were named H△8, H△5-7, and H△5-8, respectively. Polyclonal antibody was generated against the copper-binding domain of ATP7B, which was overexpressed and purified as a maltose-binding protein fusion. A single 165-kDa protein was observed in HepG2 cells with anti-ATP7B serum. The wild-type, alternative-spliced, and mutant ATP7B cDNAs were expressed in COS-1 cells. Expression of the wild-type ATP7B cDNA demonstrated the trans-Golgi network localization identical to ATP7B endogenously expressed in HepG2 cells. A 165-kDa protein was also observed in each of 4 mutant transfectants except the 2304delC mutation. However, expression of 3 mutant proteins was highly decreased compared with the wild-type ATP7B protein. These results suggest that Wilson disease was caused by the decreased expression of the functional copper transporter in the patients with the R778L, L1083F, and A874V mutations. Furthermore, the absence of functional ATP7B seems to be the reason of Wilson disease symptom in the patient with the 2304delC mutation. Expression level of the alternative-spliced H△8, A△6-7 and F△6-8 proteins was also much lower than the wild-type ATP7B protein. It appears that the variant copper-transporting ATPases occurred by alternative-splicing exist a little amount compared to the wild-type ATP7B protein. To elucidate the molecular mechanisms regulating expression of ATP7B, approximately 1.6 kb of the promoter of the human ATP7B gene was isolated, sequenced and analyzed the promoter activity from a human genomic library. Sequence analysis showed that the 5'-flanking region contains multiple binding sites for transcription factors such as AP-1, AP-2, Sp1, and E-box. Interestingly, it contains two metal response element (MRE)-one of two MREs is in the reverse orientaion-. multiple MRE-like sequences (MLS), and AFT1, an iron-responsive transcription factor, consensus sequence, but no TATA box near transcription start site. The presence of AFT1 consensus sequence in the 5'-flanking region of ATP7B indicate that the ATP7B protein may be involved in iron metabolism. The promoter activity analysis of the 5'-flanking region of the ATP7B gene using the luciferase reporter gene was shown high level luciferase activity in HepG2 cells, indicating the strong promoter function of the 1.6 kb 5'-flanking region.

윌슨씨병은 구리를 분비하지 못함으로써 유발되는 질환으로 autosomal recessive로 유전된다. 임상적인 특징으로는 bile로의 구리 분비가 일어나지 못하며, 여러 조직으로 필요한 구리를 운반하는데 관여하는 혈장 단백질인 ceruloplasmin 의 혈액내 농도가 상당히 감소되어 있는 것이다. 이 윌슨씨병 유전자는 copper-transporting p-type ATPase (ATP&B)로 21개의 exon으로 구성되어 있으며, 1,465개의 아미노산을 가진 단백질을 코딩한다. 윌슨씨병을 유발하는 돌염변이를 조사하기 위하여, 3명의 윌슨씨병환자로부터 21개의 exon을 PCR로 증폭하고, 증폭한 PCR산물을 single-strand conformation polymorphism (SSCP)을 통하여 screening한후 DNA sequencing으로 돌연변이 여부를 확인하였다. 그 결과 12개의 염기서열 변화를 확인하였으며, 새로운 A874V, L1083F, 2304delC 돌연변이와 동양인에서 흔히 발견되는 R778L 돌연변이를 발견하였다. 2304delC 돌연변이는 염기서열 2299에서 2304까지 연속적으로 존재하는 cytosine 잔기들에서 한 개의 cytosine이 deletion된 것으로 이미 보고된 2302insC 돌연변이와 함께 이 부위가 gene rearrangement가 일어나는 hot spot일 가능성을 제시하였다. 또한 6개의 새로운 polymorphism- 3244-5C→T, 1948-4C→T, 1870-2delC, Val864Ile, Val1109Met, Leu770Leu-과 2개의 기존에 보고된 Lys832Arg, Val1140Ala polymorphism을 발견하였다. ATP7B의 기능을 연구하고, 각 돌연변이의 특성을 분석하기 위하여, 4.5 kb의 ATP7B 유전자를 클로닝하였다. ATP7B 유전자를 클로닝하는 과정에서 exon 6-7과 exon 6-7-8이 deletion된 PCR산물을, 사람 adult liver cDNA와 fetal liver library에서 각각 발견하였다. 이 alternative spliced form을 각각 A△6-7과 F△6-8이라고 명명하였다. 또한 5 종류의 alternative-splicing form을 HepG2 cell에서 RT-PCR를 통하여 발견하였다. exon 8, exon 5-6-7, exon5-6-7-8 deletion form을 각각 H△8, H△5-7, H△5-8로 명명하였다. ATP7B의 N-terminus에서 6 repetitive motif로 존재하는 구리결합도메인을 maltose-binding protein과 fusion protein의 형태로 발현후 정제하였다. 이 순수 분리된 fusion protein을 이용하여 polyclonal antibody를 생산하였다. 이 항체를 이용하여 HepG2 cell에서 western blotting을 한 결과 예상된 165 kDa의 ATP7B single band를 확인할 수 있었다. ATP7B 돌연변이 단백질과 alternative splicing결과 얻어진 유전자들의 발현 양상을 조사하기 위하여 각각의 유전자를 동물세포 발현벡터에 삽입한 후 COS-1 cell에 transfection하였다. 정상 ATP7B 유전자를 발현한 경우 HepG2 세포에 존재하는 ATP7B 단백질과 마찬가지로 trans-Golgi network으로 localize하였다. R778L, A874V, L1083F, 2304delC 돌연변이를 인위적으로 ATP7B 유전자에 도입하여 만든 돌연변이 유전자를 발현한 경우 3개의 점돌연변이가 일어난 단백질은 정상 ATP7B 단백질의 발현양에 비해 그 발현 정도가 상당히 감소되었으며, 2304delC 돌연변이를 가진 단백질은 ATP7B 단백질을 만들지 못하였다. 이러한 결과들은 이들 돌연변이를 가진 환자의 경우 ATP7B의 발현이 감소되거나 결손됨으로 해서 윌슨씨병이 유발되었을 가능성을 보여주었다. alternative splicing이 일어난 H△8, A△5-7, F△5-8을 발현한 경우에도 그 발현정도가 정상 단백질에 비해 훨씬 감소되었다. 이러한 결과는 어떤 조절메카니즘을 가진 alternative spliced form의 세포내 농도는 낮게 유지하고 있을 가능성을 제시하였다. ATP7B 유전자의 간세포 특이적이고 금속이온에 의한 조절가능성을 연구하기 위하여 사람 genomic library에서 1.6 kb의 5'-flanking region을 클로닝하고, 그 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석 결과 AP-1, AP-2, Sp1, E-box와 같은 transcription factor결합부위가 발견되었다. 전사시작부위에서는 TATA box가 존재하지 않았으며, CAAT box는 훨씬 upstream에 위치하였다. 흥미롭게도, metallothionein 유전자에서 흔히 발견되는 metal response element (MRE)가 존재하였다. 그 방향이 반대로 위치란 MRE와 함께 2개의 MRE와 여러개의 MRE-like sequence (MLS)를 발견하였다. 또한 철이온에 의해 활성화되는 transcription factor인 AFT1이 결합하는 concensus sequence도 발견되었으며, ATP7B 유전자가 금속이온에 의해 조절될 가능성을 보여주었다. luciferase reporter gene을 이용한 promoter 활성을 HepG2 세포에서 조사하였을 때 강한 luciferase activity를 보임으로써 이 1.6 kb의 5'-flanking sequence가 간세포에서 강한 promoter로 작용함을 알 수 있었다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DBS 99003
형태사항 viii, 128 p. : 삽도 ; 26 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 김은경
지도교수의 영문표기 : Ook-Joon Yoo
지도교수의 한글표기 : 유욱준
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 생물과학과,
서지주기 Reference : p. 113-124
QR CODE qr code