Pseudomonas fluorescens, a gram negative psychrotrophic bacterium, secretes a thermostable lipase into the extracellular medium. In our previous study, the lipase of P. fluorescens SIK W1 was cloned and expressed in Escherichia coli, but it accumulated as inactive inclusion bodies. Amino acid sequence analysis of the lipase revealed a potential C-terminal targeting sequence recognized by ABC transporter. Genetic loci around the lipase gene were searched and a secretory gene was identified. Nucleotide sequencing of a 8.5-kb DNA fragment revealed three components of the ABC transporter, tliD, tliE and tliF upstream of the lipase gene, tliA. In addition, genes encoding a protease and a protease inhibitor were located upstream of tliDEF. A transcriptional terminator downstream of prtA and a putative promoter upstream of tliDEF revealed that tliA and tliDEF are organized as an operon. The TliDEF showed high similarity with ABC transporters of Pseudomonas aeruginosa alkaline protease, Erwinia chrysanthemi protease, Serratia marcescens lipase and Pseudomonas fluorescens CY091 protease. The tliDEF and the lipase structural gene in a single operon were sufficient for E. coli cells to secrete the lipase. In addition, E. coli harboring the lipase gene secreted the lipase by complementation of tliDEF in a different plasmid. The protease was also secreted by complementation of tliDEF in E. coli. The ABC transporter of P. fluorescens was optimally functional at 20℃ and 25℃ while the ABC transporter, aprD, aprE and aprF, of P. aeruginosa secreted the lipase and the protease irrespective of temperature between 20 to 37℃. These results demonstrated that the lipase and the protease are secreted by the ABC transporter in P. fluorescens SIK W1 and its secretory function is temperature dependent.
저온성 그람 음성균인 Pseudomonas fluorescens는 내열성 리파제를 세포 밖으로 분비한다. 본 실험실에서 P. fluorescens SIK W1에서 리파제 유전자를 클로닝하여 대장균에서 발현해본 결과 이 유전자는 함유체 형태로 세포 안에 축적되었다. 리파제의 아미노산 서열을 분석해 본 결과 ABC tranasporter에 의해 분비되는 targeting signal이 단백질 C-말단에 존재하는 것이 확인되었다. P. fluorescens 전체 유전자에서 리파제 유전자 앞 뒷부분을 찾아본 결과 분비 유전자가 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 8.5 kb의 염기서열을 밝힌 결과 ABC transporter의 3개의 유전자인 tliD, tliE, tliF가 리파제 유전자 앞쪽에 존재했으며 또한 단백질 분해 효소 유전자 (prtA)와 그의 저해 단백질 유전자 (inh)가 3개의 ABC transporter (tliDEF) 유전자 앞쪽에 존재하는 것을 알 수 있었다. prtA 유전자 다음에 존재하는 전사 종결자와 ABC transporter 유전자 앞쪽에 존재하는 전사 촉진 유전자는 리파제와 ABC transporter유전자가 하나의 operon을 구성하는 것을 의미하였다. TliDEF의 아미노산 서열은 Pseudomonas aeruginosa 염기성 단백질 분해 효소, Erwinia chrysanthemi 단백질 분해 효소, Serratia marcescens 리파제, Pseudomonas fluorescens CY091 단백질 분해 효소의 ABC transporter와 높은 유사성을 나타내었다. 하나의 operon에 존재하는 리파제와 ABC transporter 유전자를 하나의 plasmid에 넣어 대장균에 주입하였을 때 리파제가 세포 밖으로 분비되었다. 또한 리파제와 ABC transporter 유전자를 서로 다른 plasmid에 넣어 대장균에 각각 주입하였을 때도 리파제가 세포 밖으로 분비되었다. 원균주 및 대장균에서 분비되지 않는 단백질 분해 효소 유전자도 ABC transporter유전자와 함께 대장균에 넣어 주었을 때 이 효소가 밖으로 분비되었다. P. aeruginosa에서 분리된 ABC transporter는 온도에 관계없이 (20℃-37℃) 단백질을 밖으로 분비하였지만 클로닝된 P. fluorescens ABC transporter는 저온에서만 (20℃와 25℃)에서만 활성을 나타내었다. 위의 결과들로부터 P. fluorescens의 리파제와 단백질 분해 효소가 ABC transporter에 의해 분비되는 것과 이들의 분비는 온도에 영향을 받는다는 결론을 얻을 수 있었다.
