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Identification and characterization of a novel protein kinase gene prediminently expressed in hematopoietic cells = 조혈세포에서 다량으로 발현되는 새로운 단백질 키나아제 유전자의 동정 및 형질 규명
서명 / 저자 Identification and characterization of a novel protein kinase gene prediminently expressed in hematopoietic cells = 조혈세포에서 다량으로 발현되는 새로운 단백질 키나아제 유전자의 동정 및 형질 규명 / Min-Chan Gil.
저자명 Gil, Min-Chan ; 길민찬
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 1999].
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In an attempt to identify kinases that are involved in the signal transduction for cell growth, proliferation, and differentiation, a PCR-based screen for unidentified protein kinases was performed. By the PCR using degenearative primers, a cDNA of a putative kinase (HPK38) was isolated from a human keratinocyte cDNA library. The cDNA for MPK38 (the mouse homolog of HPK38) was also isolated from the murine tetracarcinoma PCC4 cell line using HPK38 cDNA. HPK38 and MPK38 were transcribed as an ~1.5kb mRNA ecoding for a protein 651 amino acids (HPK38) and 643 amino acids (MPK38). The sequence of HPK38/MPK38 showed that it is most closely to the SNF1 serine/threonine kinase family, which includes that SNF1, nim1+, KIN1,and KIN2 kinases. The N-terminal region of HPK38 and MPK38 contains the kinase catalytic domain, which exhibits approximately 60% protein sequence identity with the SNF1 serine/threonine kinase family. K1and K33 clones of HPK38 have the disrupted catalytic domain. mRNA of K1 produced translated products if ~50kDa and ~7-kDa in size in vitro. However mRNA of K3 produced only ~50kDa products. MPK38 mRNA was predominantly expressed in thymus and spleen, but was not detectable in kidney, liver, and muscle in the adult tissues. MPK38 mRNA was apparently expressed n T lineage cells and a macrophage/monocyte cells. In contrast, it was detectable in mast cell line after a longer exposure. Interestingly, the incubation of thymocytes at $37\^circ C$ resulted in the loss of MPK38 transcript, and the transcript was able to be induced by treatment with ConA or PHA, not with PMA and various growth factors such as IL-2, IL-7, TGF-beta, TNA-alpha, and EGF. The restricted expression pattern and induction of MPK38 during T cell activation suggest that MPK38 is a signal transduction molecule involved in thymocyte development. The genomic DNa containing 5' flanking region of MPK38 was isolated froma mouse luekocyte genomic library. Primer extension identified three major transcription start sites located at -264, -294, and -383 relative to exon 1-intron 1 junction site. Sequence analysis of the 5' flanking region revealed the presence of cis-acting elements for multple transcriptional regulatory facors including a N-OCT-3, a MAF, AP-1, a Yi, and Two Sp1 sites. HPK38-associated proteins, such as Two9, Two7, and Two25, were screened by yeast two hybrid with the c-terminal region of HPK38. Two9 was the most abundant clones obtained by yeast two hybrid screening. TF2, the full length clone of Two9) was islated from a human keratinocyte cDNA library. TF2 was transcribed as an ~1.9kb mRNA encoding for a protein of 460 amino acids. TF2 contained the three zinc finger motifs and showed significant homology with DNA-bindg proteins. Interaction of GST-fusted MPK38 with Flag-tagged Two9 and Two25 proteins was identified in an in vitro system using glutathion beads or in 293 cells.

세포의 성장과 분화의 신호전달에 관여하는 새로운 단백질 키나아제를 찾기위하여, 동정되지 않은 단백질 키나아제를 찾아내였다. degenerative PCR를 사용한 PCR을 이용하여서 정상적인 사람의 각질세포로부터 만들어진 cDNA 라이브러리로부터 HPK38의 cDNA를 분리하였다. MPK38은 HPK38의 cDNA를 탐침으로 사용하여 쥐의 PCC4 tetracarcinoma cell lone의 라이브러리로부터 분리하였다. HPK38과 MPK38은 전사되어서 모두 ~2.5 kDa 의 전령 RNA로 전사되고, 각가 HPK38은 651개의 아미노산을, MPK38은 643개의 아미노산을 코드 하였다. HPK38/MPK38의 염기서열을 분석한 결과, 이 단백질은 SNF1, min1+, KIN1, KIN2 키나아제들을 포함하는 SNF1 세린/트레오닌 단백질 인산화효소족과 매우 밀접함을 보여준다. HPK38/MPK38의 아미노 말단은 인산화효소의 촉매 부위를 보여준다. 이 부위는 SNF1 단백질 인산화효소와 아미노산 서열에서 약 60%의 유사성을 보인다. HPK38의 K1과 K3 클론은 잘려진 촉매 부위를 가지고 있다. K1의 전령 RNA로 부터 시험관에서 해독된어 ~50KDa과 ~70kDa의 단백질이 생산되었다. 그러나 K3의 전령 RNA로 부터는 ~50kDa의 단백질이 해독되었다. MPK38은 성체의 기관 중 흉선과 지라에서 다량으로 발현되지만 신장, 간, 그리고 근육에서는 거의 감시할 수 없다. MPK38은 명백하게 T 림프구와 대식세포/단핵세포에서 발현되었다. 시험해 본 B 림프구 세포와 대하세포를 포함한 다른 세포에서는 발현되지 않았다. 그러나 mast세포에서는 오래 노출시킨 후 전사체를 감지할 수 있었다. 흥미롭게도 흉선세포를 섭시 37도에서 배양한 결과 MPK38의전사체가 사라졌다. 그러나 전사체는 ConA와 PHA를 처리하여서 발현을 유도할 수 있었다. 그러나 PMA와 성장인자인 IL-2, IL-7, TFG-beta, TNF-alpha, EGF로는 유도되지 아니하였다. 제한적인 발현과 T 세포 활성화 시 MPK38의 유도로 볼때 MPK38은 흉선 세포의 발달에 참여하는 신호 전달 물질일 가능성이 있다. MPK38의 전사조절인자에 대해 알아보기 위해 MPK38 유전자의 5' 말단 부분을 포함한 게놈 DNA를 쥐의 leucocyte 게놈 라이브러리로부터 분리하였다. Primer extension으로 exon1과 intron1의 만나는 자리를 기준으로 -264, -294, -383에 위치하는 세 개의 전사 시작점을 확인하였다. 5' 말단의 염기 서열은 분석한 결과 N-OCT-3, a MAF, AP-1, a Yi, Sp1을 포함하는 여러개의 전사조절인자에 해당하는 잠재적인 cis-acting element들이 존재하였다. Yeast two hybrid로 HPK38에 결합하는 단백질인 Two9, Two7, Two25를 찾아내었다. Two9클론은 가장 많이 존재하며, Two9 cDNA를 이용하여 사람의 각질세포 cDNA 라이브러리로부터 전체길이의 TF2를 분리하였다. TF2는 약 1,9kb의 전령 RNA로 전사되며 460 아미노산으로 이류어진 단백질을 코드한다. TF2는 세개의 zinc-finger motif를 가지고 DNA-binding 단백질과 매우 큰 유사성을 보인다. MPK38과 Two9, 그리고 MPK38과 Two25 사이의 결합은 293 세포에서 glutathion bead를 이용하여 확인하였다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DCH 99005
형태사항 ix, 102 p. : 삽도 ; 26 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 길민찬
지도교수의 영문표기 : Young-Hoon Lee
지도교수의 한글표기 : 이영훈
수록 잡지명 : "Cloning and expression of a cDNA encoding a novel protein kinase predominently expressed in hymatopoetic cells". Gene, vol. 195, pp. 295-301 (1997)
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 화학과,
서지주기 Reference : p. 83-97
주제 kinase
PCR
Hematopoietic
Serine
Threonine
Two-hybrid
Promoter
Genome
키나아제
조혈세포
세린
트레오닌
촉진유전자
게놈
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