Nine kinds of putative protein kinase gene fragments of approximately 210 to 300 bp were isolated from Nicotiana tabacum by RT-PCR using protein kinase degenerative primers. These DNA fragments could be divided into four groups according to their deduced amino acid homology. Theses groups represent the ABA-inducible protein kinase homologs, AGC group kinase homolog, S-receptor kinase homologs, and receptor-like protein kinase homologs. One of DNA fragments included in ABA-inducible protein kinase homologs was proved to be induced transcriptionally upon wounding through northern blot analysis.
Corresponding cDNA, which may be involved in wound signal transduction pathway, was isolated. The cDNA, named WAPK (wound- and ABA-induced protein kinase), is 1,227 bp in length and contains an open reading frame of 1,017 bp. The open reading frame designates a polypeptide of 339 amino acids with a calculated molecular mass of 38,234 Da. Deduced amino acid sequence analysis shows that the N-terminal region of WAPK contains a catalytic region composed of twelve subdomains which are typically found in Ser/Thr protein kinase. This region shows 78-84% amino acid sequence identity with similar regions of abscisic acid-induced and external stimuli responsive protein kinases. However, the C-terminal region of WAPK shows little homology with similar regions of Ser/Thr protein kinases, except a 16-amino acid stretch near the end of the catalytic domain. Kinase assay using WAPK fusion protein expressed in E. coli revealed that WAPK autophosphorylates on serine residue(s). The WAPK gene was predominantly expressed in flowers, moderately in roots, and poorly in leaves. Transcripts were not detected in stems. The WAPK gene was induced by wounding (within 1.5hr), by abscisic acid (within 0.5hr), and by methyl jasmonate (within 2hr), but not by TMV infection, dehydration, and cold stress. The induction pattern of WAPK mRNA upon wounding was not affected by treatment with diethyldithiocarbamic acid, a reagent which inhibits jasmonic acid biosynthesis.
The morphology and development of tobacco plants transformed with WAPK sense or antisense expression vector was normal. WAPK antisense expressing tobacco plants constitutively expressed a wound-inducible proteinase inhibitor. These plants accumulated an osmotin homolog at 24hr after wound treatment. In wild-type plants, these bands were not detected at same treatment. Therefore, WAPK may be a negative regulator in wound-signal transduction.
식물에게 있어서의 상처는 단지 물리적인 손상 뿐이 아니라 초식동물이나 병원균 침입의 신호로 작용하여 자체의 방어기작을 가동시킨다. 이를 위한 신호전달기작은 그 중요성과 독특한 작용기작 때문에 널리 연구되어 왔다. 스트레스호르몬의 일종인 앱시식산이나 자스모닉산 등이 관여하고 있고 단백질 인산화/탈인산화과정이 필수적이라는 사실이 알려져 있으며, 최근 상처 신호전달에 관여하는 몇 가지의 단백질 인산화효소가 보고되고 있으나 그의 자세한 작용기작에 대해서는 알려진 바가 없다. 본 연구에서는 담배 식물체에서 다양한 단백질 인산화효소 유전자의 단편을 얻고, 그 중 상처에 대해 반응하는 유전자를 분리하여 상처 신호전달 기작에서의 조절양상을 규명하였다. 단백질 인산화효소 degenerate primer를 이용한 역전사 PCR을 통해 담배식물체로부터 아홉 가지의 단백질 인산화효소 유전자의 절편을 얻었으며 이들의 길이는 약 220 염기쌍 이었다. 이들 DNA 절편은 추론된 아미노산의 상동성에 따라 네 가지 그룹으로 나눌 수 있었다. 이들 그룹은 각각 ABA-inducible protein kinase 상동체, AGC group protein kinase 상동체, S-receptor protein kinase 상동체, 그리고 receptor-like protein kinase 상동체 등으로 구분된다. 이 중 ABA-inducible protein kinase 상동체에 속하는 DNA 절편 중 한가지의 전사양이 상처에 의해 증가된다는 사실을 northern blot을 통해 알 수 있었다. 이 절편에 상응하며 상처 신호전달경로에 관여할 것으로 여겨지는 cDNA를 분리하였다. WAPK라고 명명된 이 cDNA의 길이는 1,227 염기쌍이고 1,017 염기쌍의 ORF를 가지고 있다. ORF는 38,234 Da의 339 아미노산을 암호화하고 있었다. 추론 된 아미노산의 서열분석 결과 N-말단에 열 두개의 subdomain으로 구성된 촉매부위가 있으며, 이는 전형적인 Ser/Thr 단백질 인산화효소에서 발견되는 것과 일치하였다. 이 부위는 앱시식산에 의해 전사체의 양이 증가되는 단백질 인산화효소, 또는 외부 자극에 반응하는 단백질 인산화효소의 동일한 부위와 78-84%의 상동성을 보였다. 그러나 WAPK의 C-말단은 잘 보존된 16-아미노산 연속부위를 제외하고는 다른 Ser/Thr 단백질 인산화효소와 거의 상동성이 없었다. WAPK 융합단백질을 대장균에서 발현시켜 인산화효소 분석을 한 결과 WAPK는 Ser 잔기만을 autophosphorylation시킨다는 것을 알 수 있었다. WAPK 유전자는 상처에 의해 1.5 시간 내에, 앱시식산 처리에 의해 0.5시간 내에, 메틸자스모닉산에 의해 두 시간 내에 전사체의 양이 증가됨을 northern blot 분석을 통해 알 수 있었다. 그러나 TMV 감염이나 탈수처리, 그리고 저온처리는 영향을 주지 않았다. 자스모닉산 합성을 저해하는 화학물질인 diethyldithiocarbamic acid를 처리하여도 상처에 대한 WAPK 전사체 증가양상은 변하지 않았다. 따라서 자스모닉산은 WAPK의 발현을 조절하지만 자스모닉산이 WAPK 전사체 증가에 필수적이지는 않다. WAPK antisense 발현벡터로 형질전환된 담배식물체에서 상처 처리와 무관하게 상처에 의해 유도되는 Pin2가 발현되었다. 또한 상처처리 후 24시간째에 osmotin 과 상동성이 있는 전사체가 형질전환식물체에서 새롭게 축적되었는데 이런 현상은 형질전환 되지 않은 식물체에서는 찾아 볼 수 없었다.
이상의 결과를 종합해 볼 때, WAPK는 상처 신호전달경로에서 negative regulator로 작용하는 것으로 보인다.
