I. Plasma kallikrein inhibitor: A new serine proteinase inhibitor of plasma kallikrein was screened and purified from a native Korean leech species, Hirudo nipponia. The inhibitor, named piguamerin, showed potent inhibitions of plasma and tissue kallikreins as well as trypsin. Sequencing analyses by automated Edman degradation revealed 48 amino acid residues with molecular mass of 5090 Da. Piguamerin is similar to antistasin-type inhibitors with the same spacing of ten cysteines, but shows differences from hirustasin, antistasin, and ghilanten at the surrounding residues of arginine27. The purified inhibitor modulated plasma clotting in tests of activated partial thromboplastin time. The new inhibitor was the first plasma kallikrein inhibitory member of the antistasin-type inhibitors specifically found from leeches, and may be related to the regulation of blood sucking process modulating the action of kallikreins in host vessels.
II. Coagulation factor Xa inhibitor: A coagulation factor Xa inhibitor was screened and purified from the body extract of the blood-sucking leech H. nipponia. The inhibitor was found to be a polypeptide of 7366 Da named as tenastasin, with extraordinary richness in proline and lysine. It showed a specific inhibitory activity against human coagulation factor Xa with 0.5 nM of Ki value and 1:1 stoichiometric ratio, but no effect on various serine proteinases such as thrombin, trypsin, chymotrypsin, and elastase. It could prolong the clotting of human plasma at nanomolar concentrations with in vitro potency comparable to those of antistasin or tick anticoagulant peptide (TAP). The partially obtained sequence did not display high similarity toward different factor Xa inhibitors as well as proteinase inhibitors. Therefore, tenastasin, as a specific factor Xa inhibitor, might be useful for the application to various thrombotic diseases.
거머리는 흡혈동물로서 다양한 혈액응고 억제기작을 지닌 것으로 알려졌다. 한국산 거머리인 Hirudo nipponia로부터 두 종류의 혈액응고관련 단백질 분해 효소인 plasma kallikrein 및 factor Xa에 대한 강력한 억제활성을 지닌 펩타이드를 분리하여 그 아미노산 서열을 결정하고 활성을 특성 분석하였다.
Plasma kallikrein inhibitor인 piguamerin은 48개의 아미노산으로 구성되고 기존에 동일 거머리에서 발견한 elastase inhibitors인 guamerin과 Whitmania edentula에서 발견한 guamerin II, 및 유럽산 거머리인 Hirudo medicinalis의 hirustasin, Haementeria officinalis에서 발견된 antistasin과 10 개의cysteine 위치의 유사성을 보이는 antistasin-type proteinase inhibitor family의 새로운 구성체임을 확인하였다. 특별히, 이 펩타이드의 강력한 kallikrein inhibitory activity는 reactive-site P1에 arginine을 지니고 그 주위의 proteinase contacting region의 다양한 차이에 의한 것으로 사료된다. 이 펩타이드의 생체 내 기능은, kallikrein 의 주요 기능이 조직에서 bradykinin을 생성하여 혈관확장, 통증 및 염증반응을 조절하는 것으로 보아, 흡혈과정중의 host 혈액상의 유사반응을 조절할 것으로 추정된다.
Thrombin을 활성화하여 응고반응을 매개하는 또 다른 중요 효소인 factor Xa는 최근 새로운 anticoagulant therapy의 target으로 부각되고 있다. 한국산 흡혈거머리의 몸통부위에 존재하는 factor Xa 억제활성을 보이는 펩타이드를 분리하여 아미노산 서열을 결정하고 그 활성이 factor Xa에 매우 선택적임을 밝혔다. 이 펩타이드의 아미노산 서열은 기존의 알려진 factor Xa inhibitor들과 유사성이 전혀 존재하지 않으며 Haementeria officinalis에서 밝혀진 factor Xa/trypsin inhibitor인 antistasin과도 유사성이 없었다. 혈액응고 저해 활성은 antistasin보다 효율적이고 tick anticoagulant peptide (tick factor Xa inhibitor)보다는 낮은 것으로 측정되었다. 이 펩타이드의 선택적이고 강력한 활성 및 독특한 일차구조는 이 펩타이드가 거머리의 침샘에 존재하는 thrombin inhibitor와 상호 보조적인 역할로서, thrombin inhibitor는 혈액을 빨 동안 host 조직 내에서 작용하고 factor Xa inhibitor는 혈액을 장내에 보관하는 동안 보조적인 역할을 수행할 것으로 예측된다.
