Ginseng has typical flowers which contain four concentrically arranged whorls of organs in the sequence five sepals (whorl 1), five petals (whorl 2), five stamens (whorl 3), and a carpel (whorl 4). Flower development of ginseng was investigated using scanning electron microscopy (SEM) and compared with that of in vitro flowers induced by benzyladenine (BA). The development of ginseng flowers was divided into stages based on morphological markers. The surface of the inflorescence meristem became widen and then first flower primordium arose from the periphery of the inflorescence meristem. At stage 1 pre-flower primordia arose. At stage 2 bract primordium and flower primordium were completely separated. As flower primordium developed its surface became flat and widen (stage 3). However, any sign of morphological differentiation of the floral organs was not found. At stage 4 first sepal primordium arose from the periphery of the flower primordium. A second sepal primordium then arose in a position that was nearly opposite to that of the first. The remaining three sepal primordia formed nearly together. At the same time with the arise of the later three sepal primordia five petal primordia were formed in a position alternate with the first whorl primordia (stage 5 and 6). The initiation of third whorl primordia laged behind second whorl primordia (stage 7). The filaments of the stamens remained relatively short during cellular differentiation of the anther, after which the filaments elongated. Following the initiation of the second and third whorl primordia, the remaining floral meristem gave rise to the fourth whorl, which arose as two distinct primordia. During this time the sepals had grown to enclose the inner floral organs (stage 8). Flowers induced in vitro were usually smaller than those in situ or atypical in shape. The carpel primordium of in vitro flower was formed very early (stage 4 or 5), resulting in flowers containing five sepal primordia and one carpel primordium. As a whole, some of the in vitro flowers bore immature fruits but eventually degenerated before maturation.
Since MADS box genes play a central role in flower development P. ginseng MADS box genes were isolated from ginseng flowers to understand development of ginseng flower at the molecular level. In this thesis, one of them (GMADS2) was characterized. GMADS2 cDNA is 1089 bp long and has one open reading frame which encodes a protein with 242 amino acids. Comparison of the deduced amino acid sequence of GMADS2 with those of other MADS box proteins showed a high degree of homology, sharing 81% and 71% amino acid identity with NAG1 (tobacco) and AG (Arabidopsis), respectively which is specifically expressed in flower. However, its expression patterns of GMADS2 were totally different from those of AG. The GMADS2 gene was expressed in young seedling as well as in flower. In situ hybridization experiment showed that it was expressed in three inner whorls of flower and the cells surrounding a developing ovule. MADS domain of GMADS2 expressed in E. coli could bind a CArG sequence, suggesting that it is a transcription factor which may regulate development of reproductive and vegetative tissues. To investigate the function of GMADS2 it was expressed in tobacco. All transgenic plants showed no morphological abnormality of flowers. However, the transgenic plants had smaller number of node (20.8±6.6 nodes per plant) than that of control plant (25±6.6 nodes per plant), suggesting that the transgenic plants flower earlier than control plant. These results also suggested that GMADS2 may affect the meristem changes from vegetative to flower. Since BA can induce floral meristem from ginseng zygotic embryo it is possible that BA can affect the expression of GMADS2. However, in zygotic embryo and flower GMADS2 was expressed irrespective of BA treatment. To be a transcription factor GMADS2 protein has to able to activate target genes. To test this point, transient expression study using tobacco protoplasts was performed. Both NOS minimal promoter-GUS fusion containing GMADS2 binding sequence and GMADS2 cDNA under 35S promoter were electoporated into protoplasts and then GUS activity was measured. GUS activity was slightly increased by GMADS2 expression. However, when NOS minimal promoter-GUS fusion containing GMADS2 binding sequence was introduced into tobacco plants GUS activity was not detected in flowers of transgenic plants, suggesting that another factor (or factors) is required for transactivation by MADS proteins. The overall results suggest that GMADS2 is a unique MADS gene which may regulate common theme in reproductive and vegetative tissues. Or it is possible that GMADS2 could perform dual functions by interacting with different proteins in the two different tissues because GMADS2 contains a K-box, a putative protein dimerization domain at the center. Southern blot analysis suggests that there may be two or three homologous genes of GMADS2 in ginseng, suggesting that one gene is expressed in vegetative tissue and the other reproductive tissue.
인삼꽃은 각각 다섯 개의 꽃받침, 꽃잎, 수술과 하나의 암술로 이루어진 전형적인 형태를 가지고 있다. 인삼꽃 발달과정을 주사전자현미경을 사용하여 조사하였고 기내에서 형성된 인삼꽃과 비교하였다. 인삼꽃 발달과정은 형태적 특징에 따라 각 단계를 나누었다. 제 1단계. 전화아원기의 발달. 제 2단계. 화아원기가 전화아원기에서 갈라져나온다. 화아원기가 발달함에 따라 윗면이 넓어지고 평평해진다 (제 3단계). 첫 꽃받침원기가 화아원기의 가장자리로부터 생겨난다 (제 4단계). 두 번째 꽃받침원기는 첫 번째 것의 맞은편에서 생기며 약간의 시간적 간격을 두고 나머지 세 개의 원기가 동시에 발생한다. 이때 다섯 개의 꽃잎원기가 꽃받침원기 안쪽 사이사이에서 생겨난다 (제 5, 6단계). 수술원기는 꽃잎원기가 약간 자란 이후에 생기며 수술머리가 먼저 발생하고 수술대는 그 이후에 만들어진다. 암술원기는 맨 나중에 발생하며 이때는 꽃받침원기가 화아를 둘러싸게 된다. 그러나 화아가 발달함에 따라 꽃잎의 원기가 더 크게 발달하여 꽃받침보다 커지게 되고 수술머리가 거의 형태를 갖출 때 쯤에서는 꽃잎만 꽃을 둘러싸고 있다. 기내에서 호르몬처리에 의해 형성된 꽃은 형태적으로 비정상적인 경우가 많다. 이는 꽃원기의 발달순서가 바뀌고 각 원기의 성장이 저해된 결과로 생각된다.
MADS 유전자는 꽃발달에 중요한 역할을 수행하고 있는 것으로 알려져있다. 인삼꽃발달을 분자수준에서 이해하기 위하여 인삼꽃에서부터 MADS 유전자들를 분리하였다. 본 논문에서는 GMADS2 유전자의 기능을 규명하고자 하였다. GMADS2 cDNA는 1089 bp를 가지고 있었고 242개의 아미노산으로 구성된 단백질을 코딩하고 있었다. 알려진 MADS 단백질의 아미노산과 비교한 결과 담배의 NAG1과 81%, 애기장대의 AG와 71%의 상동성을 가지고 있었다. 그러나 AG와는 다르게 GMADS2는 꽃 뿐만아니라 어린 식물체에서도 발현되었다. In situ hybridization 결과 GMADS2는 수술, 암술, 꽃잎의 원기에서 발현됨을 알 수 있었고 또한 배주를 둘러싼 세포들에서 발현되어 씨방의 발달에도 관여함을 시사하였다. GMADS2의 기능을 더 조사하기 위하여 담배에 GMADS2 cDNA를 도입하였다. 만들어진 모든 형질전환된 담배는 정상적인 형태의 꽃을 가지고 있었다. 그러나 마디수가 대조군에 비해 감소하였는데 이는 형질전환담배가 대조군보다 더 빨리 꽃이 피었다는 것을 나타낸다. 이러한 결과thⓟ 담배가 영양성장단계에서 생식생장단계로 전환될 때 GMADS2가 관여한다는 것을 시사한다. Benzyladenine (BA)은 인삼 체세포배를 생식생장으로 유도할 수 있으므로 BA가 GMADS2의 발현에 영향을 줄 것으로 생각되었다. 식물호르몬이 GMADS2의 발현에 미치는 영향을 조사 하기 위하여 인삼꽃에 BA, ABA, GA3를 처리한 후 GMADS2 transcript의 양을 조사하였다. BA와 GA3는 전혀 영향이 없었으며 ABA는 GMADS2 transcript의 양을 감소시켰다. 그러나 BA와 ABA를 동시에 처리하면 ABA에 의한 저해효과가 사라졌다. 체세포배에 BA를 처리하여도 GMADS2의 발현양에는 차이가 없었다. GMADS2 단백질의 전사인자로서의 기능을 밝히기 위하여 DNA 결합유무와 전사활성을 증가시킬 수 있는지를 조사하였다. 대장균에서 발현된 GMADS2의 MADS domain은 CArG 서열을 가지는 DNA에 결합하였다. 담배원형질체를 이용하여 전사활성을 증가시킬 수 있는지 조사한 결과 약간 증가시킬 수 있음을 알 수 있었으나 그 정도는 적었다. 이는 다른 인자가 필요함을 시사하므로 담배의 MADS 단백질을 이용하여 in vivo에서 동일한 실험을 수행한 결과 MADS 단백질이 전사활성을 증가시키는 데에는 다른 인자가 필요함을 다u}ⓒ 확인할 수있었다. 이상의 결과에서 GMADS2는 생식기관과 비생식기관의 발달에 동시에 관여하는 특이한 MADS 유전자임을 알 수 있다.
