Cytochrome P4501A1 inducibility of estradiol and progesterone was investigated in mouse hepatoma Hepa 1c1c7 cells. Estradiol and progesterone increased cytochrome P4501A1-specific 7-ethoxyresorufin O-deethylase (EROD) activity at the concentrations higher than 1μM. This induction was dose- and time-related. At low concentrations less than 1μM, neither estradiol nor progesterone had EROD inducibility. To determine the possible involvement of steroid hormone receptors in the induction hormone receptor antagonists were treated together with steroids. Tamoxifen, an antagonist for estrogen receptor, could not recover the action of estradiol and RU486, an antagonist for progesterone receptor, also could not alleviate the action of progesterone. These results indicated that the EROD induction by estradiol and progesterone was independent of their cognate sex hormone receptors. In order to investigate the mechanism responsible for the EROD induction, immunoblot and northern blot analysis were performed. The increase in EROD activity by sex steroids was due to the increase in the amounts of corresponding cytochrome P4501A1 protein and CYP1A1 mRNA. Therefore, it was speculated that the CYP1A1 induction by sex steroids was dependent on transcriptional of CYP1A1 gene.
Transient transfection assay using CYP1A1-CAT reporter plasmid containing 5'-upstream regulatory region of CYP1A1 gene showed that the inserted 482 bp fragment had sufficient regulatory sequences necessary for the CYP1A1 induction by sex steroids. To identify the minimal sequences responsible for the induction, electrophoretic mobility shift assay was performed with the oligonucleotide of dioxin responsive element (DRE), which has been known to be most important in up-regulation of CYP1A1 expression. Estradiol and progesterone stimulated the formation of DRE-aromatic hydrocarbon receptor (AhR) complexes in Hepa 1c1c7 cell cultures. AhR was shown to be directly activated by binding of estradiol and progesterone displaced [$^3H$]tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) by 59% and 70%, respectively. These results clearly demonstrate that estradiol and progesterone can activate the AhR to DNA-binding forms in the same way with a prototypical CYP1A1 inducer, TCDD, to activate the transcription of CYP1A1 gene. Other steroids were tested for potency of CYP1A1-inducibility. Testosterone and progesterone-based contraceptive steroids also increased EROD activity and were shown to bind to the AhR. However, glucocorticoids such as hydorcortisone and dexamethasone failed to increase EROD activity and could not bind to the AhR. Ethinyl estradiol was unique because it could replace [$^3H$]TCDD but had no CYP1A1 inducibility. Therefore, the CYP1A1 induction by steroid compounds was thought to vary with the kinds of steroids and additional factors besides AhR binding were involved in CyP1A1 induction by steroids.
The effects of estradiol and progesterone on TCDD-induced CYP1A1 expression were also investigated to determine the interactions between these steroids and TCDD. Estradiol suppressed the TCDD-induced EROD activity in dose-dependent manner, but only at high concentrations (5, 10μM). Tamoxifen had no effect on the suppressive action of estrogen receptor in the suppression. Instead, staurosporine, a protein kinase C (PKC) inhibitor, abolished the suppressive effect of estradiol. And RT-PCR analysis of AhR mRNA and ARNT mRNA showed estradiol strongly suppressed the AhR and ARNT expression. From these results, the suppression of TCDD0induced CYP1A1 expression by estradiol was speculated to be mediated by PCK-involved signal and/or the suppression of AhR and ARNT expression. Strikingly, progesterone enhanced TCDD-induced EROD activity at high concentrations of 5-10μM. RU486 failed to abolish this stimulatory effect of progesterone, which suggested no involvement of progesterone receptor in this process. Because RU486 was a strong antagonist for glucocorticoid receptor as well as progesterone receptor, it was unlikely that the potentiation of CYP1A1 expression by progesterone might be mediated by glucocorticoid receptor as well as progesterone receptor, it was unlikely that the potentiation of CYP1A1 expression by progesterone might be mediated by glucocorticoid receptor that had been known to mediate the enhancement of TCDD-induced CYP1A1 expression by glucocorticoids. Testosterone and glucocorticoids also potentiated the TCDD induction of EROD. However, ethinyl estradiol and norgestrel suppressed TCDD-induced EROD activity. Therefore, it was concluded that the action of steroids varied with the kinds of steroids. Additional studies will explain the differences in the effects of steroid on basal- and TCDD-induced CYP1A1 expression.
Estradiol과 progesterone의 cytochrome P4501A1의 발현 촉진 기작을 Hepa 1c1c7 세포에서 조사하였다. 이 두 스테로이드는 cytochrome P4501A1의 특이적 반응인 EROD 활성을 용량 의존적으로 증가시켰다. 그러나 이러한 증가는, 세포내의 호르몬 수용체를 포화시킬 수 있는 호르몬의 농도보다 100배 이상 높은 고농도의 처리에서만 보였으며, 호르몬 수용체의 저해제를 처리하였을 때 영향이 없는 것으로 보아 처리한 두 스테로이드에 특이적인 호르몬 수용체를 경유하는 것이 아닌 것으로 생각된다. Immuno blotting과 northern blotting을 수행한 결과 스테로이드에 의한 EROD 활성의 증가가 cytochrome P4501A1의 단백질과 mRNA의 증가에 의한 것으로 밝혀졌다. Cytochrome P4501A1의 발현 조절 기작 중 가장 일반적인 모델은 원형질 내의 AhR의 활성화에 의한 것이라고 알려져 있다. 이러한 가능성을 조사하기 위해 CYP1A1 (cytochrome P4501A1의 유전자명) 유전자의 5' 전위에 있는 조절 염기열을 포함한 CAT reporter plasmid를 이용하여 transfection 실험을 수행한 결과, 스테로이드 처리에 의해 CAT의 활성이 증가하였으며, 이 결과는 삽입된 염기열이 스테로이드에 의한 cytochrome P4501A1 발현에 필요한 조절 부위를 가지고 있다는 것을 보여준다. 그 중에서도 DRE라는 enhancer는 특히 중요한 부위라고 알려져 있어, 스테로이드에 의해 DRE에 결합 가능한 단백질이 활성화되는 지를 EMSA로 확인한 결과, 스테로이드를 처리했을 때 핵 내에 DRE에 결합 가능한 AhR의 양이 증가하였다. AhR에 대한 경쟁적 결합 실험으로부터 스테로이드 화합물이 원형질 내의 AhR에 대해 결합력이 있음이 밝혀졌다. 위와 같은 일련의 실험을 통해, estradiol과 progesterone에 의한 CYP1A1의 발현은, 이 두 가지 스테로이드가 원형질 내의 AhR에 결합하여 이 수용체를 활성화 시키고, 활성화된 AhR는 CYP1A1 유전자의 5' 전위에 있는 DRE라는 enhancer 부위에 결합하여 CYP1A1의 전사를 촉진한 결과임을 보여준다.
Estradiol과 TCDD에 의한 신호 전달 체계가 서로 영향을 주는 지에 대한 이견이 있어, 이 두 화합물간의 작용에 대해서도 조사하였다. TCDD만을 처리할 경우 EROD의 활성은 용량 의존적인 감소를 보였다. 그러한 억제 효과는 고농도에서만 관찰되었으며, estradiol 수용체의 저해제를 처리했을 때 영향이 없는 것으로 보아 estradiol 수용체와는 무관한 작용으로 보인다. Estradiol의 억제작용 기작을 조사하기 위해 단백질 인산화 효소 C(PKC)의 억제제인 staurosporine을 동시 처리했을 때 estradiol의 억제 효과가 사라지는 것으로 보아 PKC가 관여하는 기작임이 확인되었다. 또한 AhR과 ARNT의 발현을 RT-PCR로 정량한 결과 estradiol은 AhR과 ARNT의 전사량을 모두 줄이는 것으로 나타났다. 따라서 estradiol의 TCDD 작용에 대한 억제 효과는 PKC가 관여하며, 세포 내의 AhR과 ARNT의 양을 고갈시키는 것에 의한 것으로 생각된다.
Progesterone의 경우 TCDD에 의한 EROD의 증가를 촉진시켰는데, 그 기작은 스테로이드 호르몬의 수용체와 무관한 경로로 이루어짐이 확인되었다. 그 밖의 testosterone, glucocorticoid나 피임제용 스테로이드 화합물의 영향에 대해 조사해 본 결과 cytochrome P4501A1의 발현 촉진이나 TCDD에 의한 cytochrome P4501A1의 발현에 대한 영향이 화합물의 종류에 따라 다양한 양상을 보였다. 따라서 cytochrome P4501A1의 발현에 대한 스테로이드의 영향은 스테로이드 화합물의 종류에 따라 다양해서 개별적으로 조사되어야 함을 보여주었다.
