In nature when materials need to be joined in most cases the only option is via adhesion, often promoted by adhesives. Since bioadhesives of marine organisms (such as mussels, barnacles and oysters) are applied and cured in moist environments, they are potentially useful for many medical and dental applications. Mussel adhesive protein is comprised mainly of about 75 repeats of the decapeptide sequence Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-HydroxyPro-HydroxyPro-Thr-Dopa-Lys. Biological synthesis system of bioadhesive protein analog in Escherichia coli was developed, because isolation of the uncured adhesive from mussels for commercial use is not practical.
For the expression of bioadhesive precursor protein in a tandem repeats, 4 expression vectors using inducible T7 expression system were developed and successfully expressed the bioadhesive precursor protein with various molecular weight. Orientation of the repeats was suppressed by the complementary nature of nonpalindromic ends generated in BlpI.
High cell density culture and high level expression are essential for the mass production of bioadhesive precursor protein. In order to achieve these goals, the effects of T7 lysozyme and plasmid size on the cell growth and production of a bioadhesive precursor protein were studied in fed-batch culture. Cell growth and bioadhesive precursor protein expression level were not significantly different between BLR(DE3)[pKYC0.8] and BLR(DE3)[pLysS] [pKYC0.8] in batch culture. In fed-batch culture, however, BLR(DE3) [pLysS][pKYC0.8] showed growth retardation and much lower level of bioadhesive precursor protein expression than that obtained with BLR(DE3)[pKYC0.8]. This result suggests that the presence of pLysS in the T7 expression system strongly affects the cell growth and expression of BP protein in high cell density cultivation. Therefore, if the target protein is not toxic to the cell, higher expression level of foreign protein can be obtained with BLR(DE3) strain without pLysS in high cell density cultures.
Also, the effect of plasmid size on the production of bioadhesive precursor protein was studied in fed-batch culture. As increasing plasmid size, plasmid copy number was decreased and level of bioadhesive precursor protein expression was decreased. In the case of BLR(DE3)[pKYC0.8], the amount of bioadhesive precursor protein increased to 35.4% of the total cell protein at 15 h after induction, which corresponded to 10.5 g/L, which is higher expression level than that reported for most other proteins produced by high cell density culture. This result suggests that plasmid copy number and insert gene size are important parameters in the optimization of large-scale production of BP protein.
자연계에서 대부분의 경우 어떤 두 물질의 접착은 접착제를 이용해야 한다. 그러나 현재 사용되고 있는 일반 접착제는 수분이 존재 시에는 사용이 불가능하다. 이에 반해 생물접착제 (특히 홍합이나 따개비가 생산하는 생물 접착제)는 수분이 존재해도 사용 가능해, 이는 의료용, 치과용 접착제 등 수분이 존재하는 모든 환경에서 응용 가능하다. 이중 홍합이 생산하는 생물 접착제는 polyphenolic 단백질로 일반적으로 10개의 아미노산이 반복적으로 연결된 구조를 가지고 있다. 단백질의 생산 시 재조합 대장균을 이용하면 단 시간에 대량의 단백질을 얻을 수 있고, 또한 분리 정제 방법이 많이 알려져 있는 등 여러 가지 장점을 가지고 있다.
본 연구에서는 홍합이 생산하는 생물접착제를 재조합 대장균에서 발현이 가능하도록, 유전자 발현 시스템을 개발하고, 이를 이용하여 생물 접착제를 대량 생산하고자 유가식 배양을 수행하였다.
일반적으로 분자량은 접착 단백질의 성능을 좌우하므로, 여러 가지 분자량을 가진 접착 단백질을 발현하는 유전자 발현 시스템인 pKYC 시리즈를 개발하였다. 또한 단백질 고분자의 발현 시스템 개발 시, nonpalindromic ends가 생기는 제한효소인 BlpI을 사용하여 방향성 문제를 해결하였다.
T7 발현 시스템에서 T7 lysozyme의 효과를 고농도에서 조사하였다. 일반적으로 T7 lysozyme은 T7 RNA polymerase의 저해제로 세포에 독성이 있는 단백질의 발현에 이용되어져 왔다. 저농도 배양인 회분식 발효에서는 T7 lysozyme을 만드는 pLysS의 존재 유무에 상관없이 생물 접착 단백질의 발현량이 비슷하였으나, 고농도 배양인 유가식 배양에서는 pLysS가 존재 시, 접착 단백질의 발현량이 현저히 감소하였다. 이는 pLysS의 존재시 이 플라즈미드가 encoding하는 chloramphenicol acetyltransferase의 과다 발현으로 인한 영양분의 burden에 기인한 것으로 생각된다. 이는 고농도의 yeast extract를 공급해 주었을 때, 접착 단백질의 발현량이 증가하는 것으로부터 알 수 있었다. 이는 발현하고자 하는 단백질이 세포에 아주 큰 독성이 없다면, 대량 생산 시에는 pLysS가 없는 균주를 사용해야 함을 알려주는 결과이다.
생물 접착 단백질의 분자량 크기에 따른 세포 성장 속도와 발현량을 비교하였다. 세포 성장 속도는 11.1 kDa의 접착 단백질을 생산할 수 있는 BLR(DE3)[pKYC0.3]의 경우가 가장 늦었고, 그 다음으로 55.6 kDa의 접착 단백질을 생산할 수 있는 BLR(DE3)[pKYC1.5]가 늦었다. 26 kDa의 접착 단백질을 생산할 수 있는 BLR(DE3)[pKYC0.8]와 44.5 kDa의 접착 단백질을 생산할 수 있는 BLR(DE3)[pKYC1.2]와의 세포 성장 속도는 거의 비슷하였다. BLR(DE3)[pKYC0.3]의 늦은 성장 속도는 플라즈미드의 높은 copy number에 기인한 것으로 생각된다. BLR(DE3)[pKYC1.5]의 경우에는 DNA의 불안정성이 관찰되어졌다. 접착 단백질의 발현량을 보면, BLR(DE3)[pKYC0.8]의 경우 총 세포 단백질의 35.4%로 약 10.5 g/L의 접착 단백질을 얻을 수 있었다. BLR(DE3)[pKYC1.2]와 BLR(DE3) [pKYC1.5]의 경우는 약 12.8%였다. 이 결과는 고분자 단백질의 생산에 plasmid 크기와 copy number의 최적화가 필요함을 의미한다. 또한 BLR(DE) 균주를 고농도로 배양시, 배양액에 ompF 단백질이 과다발현됨을 발견하였다. E. coli B 균주에서는 아직까지 이 단백질의 염기서열이 밝혀지지 않아 이를 밝힐 경우 단백질의 분비 발현에 이용할 수 있는 signal sequence로 사용 가능할 것이다.
