Saccharomyces cerevisiae transformants expressing the XYL1 gene encoding xylose reductase (XR) from Pichia stipitis were constructed using δ-sequence mediated multicopy integration vector or a YEp-type vector for the production of xylitol from xylose. Through the sequential transformations using a dominant selection marker, neo‘ and URA3 auxotrophic marker, transformants integrated chromosomally more than 30 copies of XYL1 gene were obtained. Tandem integration into a single site was most commonly observed with a maximum of three different insertion sites. The selected integrant with the highest activity showed the volumetric productivity of xylitol of 0.16-0.11 g/l/hr in sequential batch cultures and the stable xylitol production at the level of 5.5g/l in chemostat due to the stable maintenance of δ-integrated vector. In contrast, the transformant harboring a YEp-type plasmid showed mitotic plasmid instability.
Xylitol production by recombinant Saccharomyces cerevisiae strains expressing the XYL1 gene through the glucose-repressible ADH2 promoter was investigated with glucose, glycerol, acetate and ethanol as cosubstrate under oxygen-limited conditions. Among the used cosubstrates, xylitol production was the best with glucose. With glycerol, acetate and ethanol as cosubstrate, both the expression level of XYL1 gene and the cellular specific productivity were relatively high, but volumetric xylitol productivity was lower than that with glucose. When glucose was used with supplement of non-sugar cosubstrates (1% or 2% glycerol, acetate and ethanol, respectively), both the xylitol productivity and the cellular specific productivity (0.27g xylitol/l/h and 0.060 g xylitol/g cells/h with 2% glycerol, respectively) were substantially increased compared with those with only glucose (0.19 g xylitol/l/h and 0.029 g xylitol/g cells/h, respectively).
Pichia stipitis CBS5773 유래의 XYL1 유전자를 다중병렬형으로 효모 염색체에 도입할 수 있는 δ-sequence 벡터와 염색체 밖에서 자기 복제할 수 있는 플라스미드를 이용하여 자일로스에서 자일리톨을 생산할 수 있는 재조합 효모를 각각 구축하였다. 두개의 selection marker(neo‘, URA3)을 이용하여 연속적인 형질전환을 통해 xylose reductase(XR)를 코딩한 XYL1 유전자가 염색체내로 30개 이상 들어간 재조합 효모들를 얻을 수 있었고, 그 유전자삽입 및 위치를 조사한 결과 다중병렬임을 확인하였다. 가장 자일리톨 생산성이 좋은 재조합 효모를 선택하여 연속적인 회분식 배양과 연속배양을 한 결과, 자일리톨 생산성이 각각 0.16-0.11g/l/h와 5.5g/l/h 정도 수준으로 일정하고, 안정되게 생산되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 d-sequence 벡터가 유사분열시 안정되게 유지되어 진 것임을 확인하였다. 한편, 염색체 밖에서 자기 복제할 수 있는 플라스미드는 유사분열시 불안정성을 보여, 비록 초기에 자일리톨 생산성이 매우 높았지만, 장기간 배양시 적합하지 않은 것임을 알 수 있었다.
배지내 포도당에 의해 억제되고, 포도당이 고갈되었을 때 활성화되는 ADH2 promoter를 통해 XR를 코딩한 XYL1유전자를 발현시키는 재조합 효모를 구축하여, 여러 가지 탄소원 (포도당, 에탄올, 글리세롤, 아세테이트)에서 자일리톨 생산을 조사하였다. 사용된 탄소원중, 포도당 배지에서 자일리톨 생산성이 가장 좋았으며, 에탄올, 글리세롤, 아세테이트 배지에서는 XR 발현정도가 포도당 배지보다 훨씬 높았으나 생산성은 좋지 않았다. 포도당과 에탄올 또는 글리세롤, 혹은 아세테이트를 각각 첨가하여 사용했을 때, 자일리톨 생산성과 세포비 생산성이 (0.27g xylitol/l/h, 0.060 g xylitol/g cells/h) 훨씬 증가하여, 단독으로 포도당만 (0.19g xylitol/l/h, 0.029g xylitol/g cells/h) 사용했을 때 보다 각각 약 40%, 100%정도 증가하였음을 확인할 수 있었다.
