p53 has been known to exert its effects in damaged cell by leading cellular growth arrest and inducing programmed cell death, but in this studies, p53 is thought to play a role in protection against ceramide-induced apoptosis. Using human bladder carcinoma EJ cell and tetracyclin-inducible p53 expression system, EJ-p53 in which exogeneous p53 is fully overexpressed 48hrs after tetracyclin removal from the growth medium, the relation of ceramide and p53 in induction of apoptosis was investigated. 5uM of c2-ceramide has no effect on these cell lines, but at 15-50uM of c2-ceramide, acute(6-12h) induction of apoptosis is observed in EJ cell in contrast to delayed apoptosis in EJ-p53 about 20-24 h. The cytotoxic effects of c2-ceramide is intensified along with increment of concentration of c2-ceramide. When 35 uM of c2-ceramide was treated, Oligonucleosomal DNA ladder is appeared in 6 hr and reached at it's peak in 36 hr in EJ cells, but there are no appearance of DNA ladder by 48 hr in EJ-p53 cells. For investigating molecular mechanism of this delayed apoptosis, 35uM of c2-ceramide-treated cells were lysed and western blotting was performed for c-jun, which is activated by phosphorylation proceeding apoptosis. In EJ cells, c-jun protein level is elevated and increasingly phosphorylated time-dependently. But p53-overexpressed EJ-p53 cells, c-jun is already phosphorylated to some extent even in control not treated with c2-ceramide. It is suggested that c-jun is not relavant to delay of ceramide-induced apoptosis through p53.
일반적으로 apoptosis 유도 인자로 알려진 p53이 human bladder carcinoma인 EJ cell에서는 이와는 반대로 작용하였다. 즉, Tumor suppressor인 p53이 결여된 EJ cell과 이 cell에 인위적으로 p53를 넣어준 EJ-p53 cell에 c2-ceramide를 처리할 경우, 두 cell line에서 모두 처리시간과 처리농도에 따라 세포독성을 나타내었으나, EJ-p53 cell에서는 대략 24 시간정도 늦게 독성이 나타났다. 또한 DNA fragmentation을 조사해 본 결과, p53이 없는 EJ cell에서는 ceramide를 처리한지 6 시간정도에 DNA ladder가 나타났고, 36 시간 후에 최고조로 DNA fragmentation이 일어남을 알 수 있었다. 그러나 p53을 넣어준 EJ-p53 cell에서는 ceramide를 처리한 지 48 시간이 지나도 DNA ladder는 나타나지 않았다. 이것으로 보아 p53은 아직 알려지지 않은 방법으로 ceramide에 의해 일어나는 apoptosis를 억제하는 것으로 생각할 수 있다. 따라서 p53이 어떠한 경로로 이와같은 작용을 하는지 알아보기 위해서, c-Jun의 활성이 어떻게 변하는지 알아보았다. 왜냐하면, 많은 연구결과, apoptosis가 일어나기 전에 c-Jun이 활성화된다고 보고되고 있기 때문이다.
실험 결과, EJ cell에서는 ceramide를 처리한 후 c-Jun protein의 양도 증가할 뿐만 아니라, 시간이 지남에 따라 활성도 증가함을 알 수 있었다. 그러나 EJ-p53 cell에서는 시간이 지남에 따라 protein양은 증가하였지만, ceramide를 처리하지 않았을 때에도 이미 c-Jun은 어느정도 활성화가 되어 있었고, 활성화 정도도 증가하지 않았다. 따라서 c-Jun은 결정적인 역할을 하지 않는 것으로 생각된다.
