Taxonomic studies based on classical phenotypic data have been eclipsed by developments in molecular systematic studies. Actually, numerous microbial taxa, especially prokaryotic organisms, have been taxonomically revised by molecular systematic studies. Recent chemotaxonomic and molecular systematic approaches toward microbial systematics have played a significant role in establishing the systematics of actinomycetes. In this study, two actinomycete taxa, namely the genera Saccharomonospora and Nocardioides, were studied in detail by molecular systematic techniques, together with phenotypic analysis if necessary.
The 16S ribosomal DNA (rDNA) sequence analysis showed that the genus Saccharomonospora is a distinct phyletic group within the evolutionary radiation of the family Pseudonocardiaceae. The 16S rDNA sequences of the four validly described Saccharomonospora species exhibited relatively high levels of nucleotide similarity. The 16S rDNAs of most Saccharomonospora species were more than 98% similar; the only exception was S. viridis. S. azurea and "S. caesia" strains had identical 16S rDNA sequence. Intraspecific sequence variation were not found in S. viridis and "S. caesia", and the 16S rDNA sequence of the type strain of S. glauca differed by only one nucleotide from those of other S. glauca strains. Saccharomonospora sp. strain K180 had a sequence that was different from the sequences of the four validly described Saccharomonospora species. The ribotype patterns of the four validly described Saccharomonospora species allowed these taxa to be distinguished. Each ribotype patterns are species-specific. The additional strains produced patterns identical to those of the corresponding representative species. By 16S rDNA sequences analysis and ribotype patterns, some strains previously identified as S. viridis were reclassified as members of other Saccharomonospora species, and unidentified Saccharomonospora strains were identified. The 16S-23S and 23S-5S ITS sequences were sufficient to make the relationships between Saccharomonospora species clear from great variability in sequence and length polymorphisms. In addition, for the most part the two ITSs of Saccharomonospora strains did not exhibit intraspecific sequence divergence. S. azurea and "S. caesia" were shown to be highly closely related from 16S rDNA and two ITS sequences and ribotype patterns. S. azurea and "S. caesia" are proposed to be combined as one species, S. azurea, based on DNA-DNA relatedness. Saccharomonospora sp. strain K180 is proposed as a new species of the genus Saccharomonospora from DNA-DNA relatedness with other species. Saccharomonospora strains could be rapidly identified by using RFLP analysis of amplified-16S rDNA and multiplex PCR based on 16S rDNA sequence. These methods were rapid, simple, reproducible, and species-specific.
The 16S rDNAs from 41 strains attributed to the genera Nocardioides, Aeromicrobium, and Terrabacter were directly sequenced. The type strains of validly described Nocardioides species exhibited levels of average nucleotide similarity of 96.1% ± 3.0% and formed phylogenetic cluster distinct from other genera. Two Aeromicrobium species formed phylogenetic lineages distinct from the genus Nocardioides. The 16S-23S ITS sequences were useful to infer the relationships between closely related strains and species of the genus Nocardioides from length polymorphisms and sequence divergences. From 16S rDNA and 16S-23S ITS sequence analyses, it was considered that some strains attributed to the genus Nocardioides should be taxonomically reevaluated and should be proposed as new taxon. N. albus strains, N. luteus, "N. flavus" strains, and type strain of "N. fulvus" were shown to be closely related to each other from 16S rDNA and 16S-23S ITS sequences. N. simplex strains ATCC 13260, ATCC 19565, and ATCC 19566 exhibited low levels of 16S rDNA similarity to Nocardioides species including type strain of N. simplex. The three strains were reclassified as members of Rhodococcus erythropolis from phylogenetic analysis based on 16S rDNA sequences and chemotaxonomic analyses. "N. fulvus" IFO 14399 and Nocardioides sp. ATCC 39419 formed phylogenetic lineages distinct from the genus Nocardioides and other LL-DAP-containing taxa. The two strains also were different from the genus Nocardioides in chemotaxonomic characteristics. Therefore, "N. fulvus" IFO 14399 and Nocardioides sp. ATCC 39419 were considered as members of new genus, Kribbella. Two Nocardioides-like strains which are of biotechnologically importance, strains NSP40 (OS4) and NSP41, were taxonomically investigated to determine their exact taxonomic positions. The strain NSP40 exhibited levels of 16S rDNA similarity of 95.0 to 95.7% with other Nocardioides species and showed chemotaxonomic properties which are similar to those of the genus Nocardioides. Therefore, strain NSP40 is proposed as a new species of the genus Nocardioides, "N. pyridinolyticus". The strain NSP41 was shown to be related to N. simplex from 16S rDNA sequence. However, strain NSP41 was distinguished from N. simplex by 16S-23S ITS sequence, DNA-DNA relatedness, and some phenotypic characteristics. Therefore, strain NSP41 is proposed as a new species of the genus Nocardioides, "N. nitrophenolica". The multiplex PCR using species-specific primers within 16S rDNA allowed rapid identification of the validly described Nocardioides species.
분자생물학적 방법을 이용한 미생물의 계통분류의 발달은 표현형질을 주로 이용하는 고전적인 분류방법에 대한 의존도를 감소시켜 왔다. 실제로 수많은 미생물, 특히 원핵생물의 많은 종 (species) 들이, 분자계통학적 분류방법에 의해서 재분류 되어왔다. 최근에 화학분류 및 분자계통분류는 방선균의 분류체계를 확립하는데 중요한 역할을 해왔다. 본 연구에서는, 방선균의 두 속 (genus), Saccharomonospora 와 Nocardioides가 분자계통학적 방법과 필요할 경우 표현형질에 의해서 분류학적으로 연구되었다.
16S rDNA 염기서열 분석에서 Saccharomonospora 속의 종 및 균주들은 Pseudonocardiaceae과 (family) 안에서 뚜렷한 계통학적 그룹을 형성하였다. 공식적으로 인정된 Saccharomonospora 속의 4 종은 16S rDNA 염기서열에서 높은 상동성을 보여주었다. S. viridis를 제외한 나머지 종은 98% 이상의 상동성을 보여주었고 S. azurea와 "S. caesia"의 균주들은 동일한 염기서열을 가지고 있었다. S. viridis와 "S. caesia"에서 종내의 염기서열 변이는 발견되지 않았고 S. glauca의 표준균주는 S. glauca의 다른 균주와의 비교에서 1 bp의 차이만을 가지고 있었다. Saccharomonospora sp. K180은 다른 종들과 구별되는 16S rDNA 염기서열을 가지고 있었다. Ribotype pattern은 각각의 Saccharomonospora 종을 구별해주는 결과를 보여주었다. 16S-23S 및 23S-5S ITS의 염기서열과 길이에서 볼 수 있는 큰 변이는 Saccharomonospora 종 사이의 관계를 분명히 해줄 수 있었다. 대부분의 종에서 16S-23S ITS 염기서열의 종내변이는 발견되지 않았다. 16S rDNA 염기서열 분석, ITS 염기서열 분석과 ribotyping 결과에 의해서, 이전에 S. viridis로 동정되었던 어떤 균주는 다른 종의 균주로 재분류 되었고, 몇몇 미동정 균주는 상응하는 종으로서 동정되었다. S. azurea 과 "S. caesia"는 위의 결과들에서 상당히 높은 유연관계를 보여주었고, DNA-DNA 상동성 결과에 의해서 S. azurea로서 하나의 종으로서 통합할 것을 제안한다. Saccharomonospora sp. K180은 DNA-DNA 상동성 결과에 의해서 새로운 종으로 제안한다. PCR- 증폭된 16S rDNA의 RFLP 분석과 16S rDNA를 이용하는 multiplex PCR 기법은 Saccharomonospora 균주를 신속하게 동정할 수 있는 유용한 방법이었다. 이런 방법들은 신속하고, 간단하고, 종 특이적이며 재현성을 보여주었다.
Nocardioides 속, Aeromicrobium 속, Terrabacter 속의 41균주의 16S rDNA 염기서열을 결정하였다. 공식인정된 Nocardioides 종의 표준균주들은 평균 96.1% ± 3.0%의 16S rDNA 상동성을 보여주었고, 다른 속과 구분되는 뚜렷한 계통학적 그룹을 형성하였다. Aeromicobium 속의 두 종은 Nocardioides와 구분되는 계통학적 그룹을 형성하였다. 16S-23S ITS는 길이와 염기서열의 큰 변이에 의해서 Nocardioides 속의 밀접히 연관된 균주 또는 종간의 관계를 규명하는데 유용하였다. 16S rDNA 및 16S-23S ITS 염기서열의 분석에서, Nocardioides로서 분류되었던 어떤 균주들은 분류학적으로 재조사 되거나 새로운 taxon으로서 제안되어야 할 것으로 생각되었다. N. albus 균주들, N. lutues, "N. flavus" 균주들, "N. fulvus"의 표준균주는 16S rDNA 및 16S-23S ITS 염기서열의 분석 결과로부터 상당히 높은 유연관계를 보여주었다. N. simplex의 3 균주, 즉 ATCC 13260, ATCC 19565, ATCC 19566은 N. simplex의 표준균주 및 다른 Nocardioides 종에 낮은 16S rDNA 상동성을 보여주었다. 그 3 균주는 16S rDNA 염기서열에 기초한 계통학적 분석과 화학분류학적 분석에 의해서 Rhodococcus erythropolis의 균주로서 재분류되었다. "N. fulvus" IFO 14399와 Nocardioides sp. ATCC 39419는 Nocardioides 속 및 다른 LL-DAP를 가지고 있는 속들에 구별되는 계통학적 그룹을 형성하였다. 두 균주는 또한 화학분류학적 특징에서 또한 Nocardioides 속과 차이를 보여주었기 때문에, 새로운 속, 즉 Kribbella의 종으로서 제안되었다. 산업적으로 유용한 두 균주, 즉 NSP40 (OS4)와 NSP41의 정확한 분류학적 위치를 결정하였다. NSP40은 다른 Nocardioides 종들에 95% - 95.7%의 16S rDNA 상동성을 보여주었고 Nocardioides 속에 유사한 화학분류학적 특징을 가지고 있었다. 그러므로 NSP40을 Nocardioides 속의 새로운 종, N. pyridinolyticus로서 제안한다. NSP41은 16S rDNA 염기서열 분석에서 N. simplex에 가장 유사한 균주로 생각되었다. 하지만, NSP41은 16S-23S ITS 염기서열, DNA-DNA 상동성, 몇몇 표현형질의 차이의 결과로부터 N. simplex로부터 구별할 수 있었다. 그러므로, NSP41을 Nocardioides 속의 새로운 종, N. taejonensis로서 제안한다. 16S rDNA 염기서열의 종특이적 primer를 응용한 multiplex PCR은 Nocardioides 종들의 신속한 동정을 가능하게 해주었다.
