Recombinant Chinese hamster ovary (CHO) cells expressing a high level of chimeric antibody against S surface antigen of hepatitis B virus were obtained by cotransfection of heavy and light chain cDNA expression vectors into dihydrofolate reductase (dhfr)-deficient CHO cells and subsequent gene amplification in medium containing stepwise increments in methotrexate (MTX) level such as 0.02, 0.08, 0.32, 1.0 and 4.0μM. The highest producer (HP) subclone was isolated from each MTX level and was characterized with respect to cell growth and antibody production in the corresponding level of MTX. Specific growth rate of the HP subclone was inversely proportional to the MTX level. On the other hand, its specific antibody productivity ($q_{Ab}$) rapidly increased with increasing MTX level up to 0.08μM and thereafter, it gradually increased to $20 \mug/10^6$ cells/day at 4 \mu M MTX. Southern blot analysis showed that the enhanced $q_{Ab}$ at higher MTX level resulted from immunoglobulin (Ig) gene amplification. The stability of the HP subclones isolated at 0.02, 0.08, 0.32, and 1.0μM MTX in regard to antibody production was investigated during long-term culture in the absence of MTX. The $q_{Ab}$ of all subclones significantly decreased during the culture. However, the relative extent of decrease in $q_{Ab}$ was variable among the subclones. The HP subclone isolated at 1μM MTX was most stable and could retain 59% of the initial $q_{Ab}$ after 80 days cultivation. Southern blot analysis showed that this decrease in $q_{Ab}$ of the subclones resulted mainly from the loss of Ig gene copies during long-term culture. Despite the decreased $q_{Ab}$, the HP subclone isolated at 1μM MTX could maintain high volumetric antibody productivity over three months because of improved cell growth rate during long-term culture.
Southern detection of 23-kb DNA fragment containing light and heavy chain cDNAs of chimeric antibody as well as DHFR in NheI-cut genomic DNAs from amplified HP subclones, showed that light and heavy chain cDNAs were coamplified in the steps of DHFR-mediated gene amplification. Using fluorescence in situ hybridization, the integrated DNA carrying light and heavy chain cDNAs and DHFR was localized on the metaphase chromosomes of CS13, parental cell line and the amplified HP subclones, and marker chromosomes carrying amplified DNA were identified. Chromosomal location of the integrated DNA and its amplified array in CS13 and CS13*-0.02, the HP subclone isolated at the first step of DHFR-mediated gene amplification, indicated that the gene amplification process was initiated in the chromosome carrying the integrated DNA by breakage-fusion-bridge cycle mechanism of chromatid type. This was strongly supported by the observation of sister chromatid fusion and dicentric chromosomes. In the HP subclones isolated at further rounds of gene amplification, the amplified arrays were distributed to various marker chromosomes. Although presence of MTX was helpful for maintaining phenotypic stability of the amplified HP subclones during long-term culture, it disturbed their genotypic stability by causing coexistence of heterogeneous populations. In the absence of MTX, genotypically homogeneous populations with reduced amplified array became dominant after long-term cultures of HP subclones. Different fate of marker chromosomes carrying amplified DNA during long-term cultures of HP subclones in the absence of MTX, suggested genetic environments surrounding amplified DNA might determine stability of the amplified DNA. $(TTAGGG)_n$ sequences present around the telomeric end of amplified array seemed to be responsible for stable maintenance of the amplified DNA during long-term evolution of the marker chromosomes. In conclusion, it is prerequisite for establishment of amplified cell lines for consistent production of target proteins in large scale, to assess their genotypic stability during long-term culture in the absence of selective pressure.
B 형 간염 바이러스의 S 표면 항원에 대한 키메라 항체의 Heavy 사슬과 Light 사슬의 cDNA 발현벡터를 Dihydrofolate reductase (DHFR)이 결여된 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에 cotransfection 하고 Methotrexate (MTX)의 농도를 단계적으로 높인 배지 (0.02, 0.08, 0.32, 1.0, 4.0μM MTX)에서 DHFR 유전자 증폭을 행함으로써, 키메라 항체의 고발현성의 재조합 CHO 세포를 얻었다. 각각의 MTX 농도에서 가장 높은 생산성을 보인 Subclone (HP subclone)을 분리하였고, 이들의 세포생장과 항체생산에 대한 특성을 조사하였다. HP subclone 들의 단위생장속도 (specific growth rate)는 MTX 의 농도에 역비례하였고, 반면에 그들의 단위항체생산속도 (specific antibody production rate, $q_{Ab}$) 는 0.08μM 까지 MTX의 농도가 증가함에 따라 급격히 증가하였고, 그 이후 점진적으로 증가하여 4μM의 MTX에서는 그 값이 $20 μg/10^6 cells/day$에 이르렀다. Southern blot 을 통한 분석에서 이러한 $q_{Ab}$의 증가가 항체 유전자의 증폭에 기인함을 알 수 있었다. 0.02, 0.08, 0.32, 1.0 μM에서 분리한 HP subclone의 항체 생산 안정성을 MTX가 없는 배지에서 장기배양을 행하면서 조사하였다. 모든 HP subclone의 $q_{Ab}$는 배양동안 현저하게 감소하였다. 그러나 $q_{Ab}$의 상대적인 감소 정도는 subclone 마다 차이를 보여서, 1.0μM의 MTX에서 분리된 HP subclone이 가장 안정하였고, 80 일간의 배양 후에도 초기 $q_{Ab}$의 59 %를 유지할 수 있었다. Southern 분석을 통해 이러한 $q_{Ab}$의 감소가 항체 유전자의 소실에 기인함을 알 수 있었다. 1.0μM의 MTX에서 분리된 HP subclone은, $q_{Ab}$의 감소에도 불구하고, 장기배양시의 세포생장속도의 증가로 인해 3 개월 이상 높은 단위부피항체생산속도 (volumetric antibody productivity)를 유지할 수 있었다.
HP subclone 들의 genomic DNA에서 Light 사슬과 Heavy 사슬 cDNA와 DHFR이 포함된 23-kb의 DNA 절편을 Southern을 통하여 확인함으로써 키메라 항체의 Light 사슬과 Heavy 사슬 cDNA가 DHFR 유전자 증폭의 각 단계에서 함께 증폭되었음을 알 수 있었다. Fluorescence in situ hybridization (FISH)를 이용하여 Light 사슬과 Heavy 사슬 cDNA와 DHFR이 포함된 integrated DNA의 metaphase chromosome 상의 위치를 모세포주인 CS13과 유전자 증폭된 HP subclone 에서 결정하였고, 증폭된 DNA를 가진 marker chromosome 들을 확인 분류하였다. CS13과 유전자 증폭의 첫 단계에서 분리된 HP subclone, CS13*-0.02에서의 integrated DNA와 증폭된 유전자의 chromosome 상의 배열은 그 유전자 증폭과정이 chromatid type의 breakage-fusion-bridge cycle mechanism에 의해 integrated DNA가 존재하는 chromosome에서 시작되었음을 암시하였다. 이는 sister chromatid fusion과 dicentric chromosome의 관찰로 강력하게 지지되었다. 두 번째 이상의 유전자 증폭 단계에서 분리된 HP subclone 들에서는 증폭된 유전자의 배열이 다양한 marker chromosome으로 분산되어 존재하였다. MTX의 존재는 장기배양시의 HP subclone의 표현형 ($q_{Ab}$)의 안정성을 유지하는 것에는 도움을 주었으나, 잡다한 개체군들의 공존을 가능하게 하여 오히려 그들의 유전자형의 안정성을 방해하였다. MTX 부재시에는, HP subclone의 장기배양 후, 감소된 증폭 유전자 배열을 가진 유전형적으로 동질의 개체군들이 우점종이 되었다. 증폭된 유전자를 가진 marker chromosome 들의 HP subclone의 장기 배양동안의 각기 다른 운명은 증폭된 유전자를 둘러싼 유전적 환경이 그 증폭된 유전자의 안정성을 결정할 것이라는 암시를 주었다. 증폭된 유전자 배열의 telomere 쪽의 말단에 존재하는 $(TTAGGG)_n$ sequence는 marker chromosome 들의 장기간의 진화 과정에서 그 안에 포함된 증폭된 유전자의 안정한 유지에 밀접히 관여할 것으로 여겨졌다. 결론적으로, 목적 단백질의 안정한 대량생산을 위한 유전자 증폭된 세포주의 확립을 위해서는, selective pressure가 없는 상태에서 장기배양을 통해 그들의 유전자형의 안정성을 먼저 평가해야겠다.
