To understand the transcriptional regulation of the rat phospholipase C-β3 (PLC-β3) gene, the 5'-upstream region has been characterized. Sequence analysis of the 5'-upstream region showed that it contains a GC-rich region (-166 to +1: 79%) and multiple binding sites for the transcription factors Sp1, AP-1 and AP-2 but does not contain a canonical TATA box. It also showed that a 0.4 kb fragment including the proximal promoter, the first exon, and part of the first intron, contain several CpG dinucleotides, consistent with CpG island. These structural features, with the high G+C rich content, absence of TATA box and presence of the CpG island, show similarities to that of the promoters of various housekeeping genes. Primer extension analysis of total RNA isolated from rat glial cell C6Bu1 revealed that single transcription start site is located at a initiator (Inr) element similar to that found in the HIV promoter. Gel mobility shift and competitive mobility shift assays indicated that this in itiator element forms a DNA-protein complex with the HIV Inr-binding protein, LBP-1/CP2 or a homologue. Ectopic expression of LBP-1 can stimulate the promoter activity of the PLC-β3 gene when analyzed in transient co-transfection assay. These results indicated that LBP-1/CP2 can stimulate transcription through initiator element in the PLC-β3 promoter, although the exact mechanism remains unclear. In order to localize functional elements of the 5'-upstream region of the rat PLC-β3 gene, 5'-deletion fragments were cloned into a chloramphenicol acetyltransferase (CAT) reporter vector. Transient transfection analyses of the 5'-deletion mutants identified a crucial promoter element located at -128 to -14. Gel mobility shift assay and DNase I footprinting analysis showed that the crucial promoter element contains four regulatory element, one A-box and three GC boxes. A-box (+112/+99) is identified as a novel regulatory element through sequence comparison with known regulatory element. Gel mobil ity shift assay and mutational analysis revealed that this element forms DNA-protein complex with unidentified C6Bu1 nuclear protein and can act as a positive regulatory element. Supershift mobility assay indicated that Sp1 binds to three GC boxes within the crucial promoter region. Transient transfection analyses of promoter constructs containing site-specific mutation(s) of these three GC boxes demonstrated that two among three GC boxes are required for optimum promoter activity.
쥐 Phospholipase C-β3 (PLC-β3) 유전자의 전사가 어떻게 조절되는지 알아보기 위해 여러 분자생물학적 기법을 이용하여 이 유전자의 5'부위에 대한 연구를 수행하였다. 쥐 PLC-β3 cDNA의5'DNA단편을 이용하여 쥐 genomic library를 탐색한 결과 얻은 5'부위의 염기 서열에는 뉴클리오타이드 G와 C 가 많은 부위 (-166 부터 +1:79%), 그리고 전사인자가 붙을 수 있는 위치가 많이 존재함을 알 수 있었다. 그러나, 많은 promoter들이 가지고 있는 TATA box는 존재하지 않았다. 또한 유전자의 5'부위는CpG island로 추론되는 부위, 즉 다수의 CpG 다이뉴클리오타이드를 가지는 부위를 포함하고 있었다. 이러한 구조적 특징들은, 즉 높은 G와 C의 빈도, TATA box가 없는 것 그리고 CpG island의 존재는 다양한 housekeeping 유전자들의 promoter에서 보여지는 특징과 매우 유사함을 알 수 있었다.
다음으로 PLC-β3 유전자의 전사 시작 부위를 알아보기 위해 쥐 glial 세포 C6Bu1으로부터 RNA를 추출 후 primer extension 실험을 한 결과 ATG로부터 5'쪽으로 137 뉴클리오타이드 떨어진 C 잔기에서 전사가 시작됨을 알았다. 이 전사 시작 부위를 포함하는 주변 염기서열은 HIV promoter의 initiator와 유사성을 보였으며 이 부위에는 HIV initiator에 붙는 단백질로 알려진 LBP-1/CP2가 붙는다는 것을 Gel mobility shift 실험 등을 통하여 알 수 있었다. 또한 LBP-1/CP2를 발현하는 백터를 이용한 co-transfection 실험을 한 결과, LBP-1/CP2가 전사 시작 부위에 붙어서 PLC-β3 promoter의 활성을 증가 시킨다는 사실을 알 수 있었다.
마지막으로 PLC-β3 염기서열 중 promoter의 활성에 중요한 부위를 알아보기 위해 5'-deletion 돌연변이를 CAT 백터에 클로닝한 후 transient transfection 실험을 수행하였다. 그 결과 -128부터 -14까지 해당되는 부위가 PLC-β3 promoter의 활성에 중요함을 알 수 있었다. 이 부위에는 4개의 전사 조절부위 (한개의 A-box 그리고 세개의 GC box)가 존재한다는 것을 Gel mobility shift 실험과 DNase I footprinting 실험 등으로 알 수 있었다. A-box의 경우 염기서열이 기존의 다른 promoter에 작용하는 전사 조절부위와 유사성이 없는 새로운 조절부위였으며 또한 이 부위의 염기서열을 변화시킨 돌연변이 promoter의 경우 활성이 감소되는 것으로 보아 이 조절부위가 PLC-β3 promoter의 활성에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다. 세 개의 GC box 경우 이들 부위에 전사 인자 Sp1이 붙는 다는 것을 Sp1항체를 이용한 supershift 실험으로 알 수 있었다. 또한 이들 세개의 GC box 염기 서열을 각각 또는 동시에 변화시킨 돌연변이 promoter를 이용한 transient transfection실험 결과 이들 중 전사 시작 부위에 가까운 위치에 있는 두개의 GC box가 PLC-β3 promoter의 활성에 중요하다는 것을 알 수 있었다.
