A serum-free medium with balanced amino acids was established for a high-density perfusion culture of a recombinant CHO cell line producing urokinase-type plasminogen activator (u-PA). Several protease inhibitors were examined for the prevention of significant conversion of scu-PA into tcu-PA, and a serine protease inhibitor, aprotinin was optimal at a concentration of 10 KIU ml. Serum-free or protein-free culture was proven to be more favorable for the prevention of the conversion of scu-PA than a serum-containing culture. A serum-free medium composed of IGF-I, transferrin, EGF and PDGF was constructed during the course of weaning cells to sequential reductions in FBS concentrations (5%, 3%, 2%, 1%, 0. 5% and 0.1%). In addition to the cells adapted to serum-free medium, cells adapted completely to a protein-free basal medium without any exogenous supplements except MTX and aprotinin was obtained. In tissue-flask cultures (25 ㎠), cells propagated to a density of $1.2×10^6$ cells/ml after 5 days in the serum-free medium, and their specific growth rate and specific productivity of u-PA were $0.026 h^{-1}$ and $134±58 IU/10^{-6}$ cells ㆍday, respectively.
To balance nutrients in a perfusion medium, cellular requirements for amino acids were examined by a trial-and-error method, and a fortification of amino acids (aspartic acid, asparagine, serine, glutamine, threonine, arginine, valine, tryptophane, isoleucine, leucine, and methionine) was made.
A control strategy for perfusion cultures was developed based on cellular consumption of oxygen and glucose and the perfusion performance was evaluated. Influences of microcarriers (solid and porous) and of different media (serum-free and serum-containing) were investigated. Using a solid microcarrier, cell growth and u-PA production were suppressed 2 ~ 3 times in the serum-free culture as compared with that in the control culture with 1% FBS medium.
Using a porous microcarrier, cell growth and u-PA production were enhanced significantly as compared with those observed using a solid microcarrier. All the values of the parameters related to cell growth and u-PA production were fairly comparable or even higher than those in the control culture using 1% FBS medium and a solid microcarrier. A 13% higher scu-PA portion of u-PA was noticed in the serum-free cultures compared with that in the control culture using 1% FBS medium.
The stability of perfusion cultures were investigated by examining time-course samples of cells and secreted proteins in the culture supernatants. Changes in product quality and cellular physiological behavior was examined closely by employing two-dimensional electrophoresis (2-DE). Scu-PA was identified as a 56 kDa protein whose pI value was about 8.6. Neither heterogeneity of scu-PA nor a change in patterns of other spots was identifiable throughout perfusion cultures. Genomic DNA extracted from cells or cells themselves of perfusion cultures were analyzed by agarose gel electrophoresis and flow cytometric analysis, and no sign of apoptosis was noted, suggesting that the perfusion cultures were stable.
Urokinase형 plasminogen activator (u-PA)를 생산하는 재조합 CHO의 고농도 perfusion배양에 적합한 무혈청 균형 배지를 확립하였다. 배양 중 scu-PA의 tcu-PA로의 전환을 방지하기 위하여, 각종 단백질분해효소 저해제를 조사한 결과, serine계열의 단백질 분해효소저해제인 aprotinin을 10 KIU ml의 농도로 사용할 때 최적의 효과를 얻을 수 있었으며, 무혈청 또는 무단백질 배지를 사용할 때에 더욱 효과적이었다. 단계적으로 FBS 농도를 낮춘 배지 (5%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 와 0.1%)에 세포를 적응시키면서 IGF-I, transferrin, EGF, PDGF로 구성되는 무혈청 배지를 design 하였다. 또한, MTX와 aprotinin 이외에 다른 성분을 첨가하지 않은 무단백질 배지에 적응된 세포주도 얻을 수 있었다. Flask (25㎠) 배양에서 무혈청 배양을 하였을 때, 세포농도는 5일 후 최고 $1.2×10^6$ cells/ml 까지 증가하였으며, 그 때의 세포의 비생장속도와 u-PA의 비생산속도는 각각 $0.026h^{-1}$와 $134±58 IU 10^{-6}$ cellsㆍday 이었다.
영양소가 균형된 perfusion 배지를 만들기 위해, 세포의 아미노산요구성을 시행 착오법으로 조사하고, 11가지의 아미노산의 농도를 강화한 배지를 확립하였다. (aspartic acid, asparagine, serine, glutamine, threonine, arginine, valine, tryptophane, isoleucine, leucine, and methionine).
세포의 산소 및 포도당 소비속도를 고려하여, perfusion배양의 제어방식을 확립하고, 그것을 이용한 perfusion performance를 평가하였다. 또한, perfusion performance에 대한 서로 다른 microcarriers (solid and porous)와 서로 다른 배지 (무혈청 배지와 혈청 배지)의 영향을 비교 분석하였다. 그 결과, solid microcarrier를 사용할 경우, 무혈청 배지에서의 세포의 생장과 u-PA 생산은 혈청 배지에서와 비교할 때 약 2 ~ 3 배떨어졌으나, porous microcarrier를 사용하면 무혈청 배양을 하더라도 세포의 생장과 u-PA 생산이 크게 향상되었다. 무혈청 배지와 porous microcarrier를 사용한 경우에 얻어진 세포의 생장과 u-PA 생산에 관련된 제반 인자들을 혈청 배지를 사용한 배양에서와 비교할 때, 상기의 결과는 타당성이 있었다. 또한, 무혈청 배양의 경우, 혈청배지를 사용한 경우에서 보다 scu-PA의 분율을 약 13%정도 더 높일 수 있었다.
perfusion 배양의 안정성을 조사하기 위하여, 배양중 취한 세포와 그 상청액을 각각 조사하였다. 상청액은 two-dimensional electrophoresis (2-DE) 법을 이용하여, product의 quality와 세포의 생리적 변화를 분석하는 데 사용하였는 데, 그 결과 scu-PA는 pI값이 약 8.6인 56 kDa 의 단백질로서, 배양 중 그 물성에 어떠한 변화도 없었으며, 세포가 분비한 기타 단백질의 양상에도 어떠한 변화가 없었다. perfusion cultures배양중 취한 세포 시료와 그로부터 추출한 DNA를 agarose gel 전기영동법와 flow cytometry 를 이용하여, 배양 중 세포의 apoptosis 여부를 조사하였다. 결론적으로, 세포는 배양 전반에 걸쳐 apoptosis의 현상을 보이지 않았으며, 본 연구에서 확립된 제어방식에 따라 운영된 perfusion cultures배양은 전반적으로 안정하게 진행되었다.
