Mutants defective in the high-affinity transport for D-ribose are still able to utilize the sugar as a sole carbon and energy source, suggesting that other low-affinity transport systems for the sugar exist in the cells. In order to search for these transport systems, transposon mutagenesis for the high affinity transporter-defective cell was performed and several dozens of candidates showing different phenotypes on D-ribose minimal growth were isolated with a frequency of $1\times10^{-5}$. The precise locations of insertions on the chromosome were determined by in vivo cloning and analysis using polA mutation. By genetic and biochemical studies of the mutants it was revealed that two transport systems for D-xylose (XylFGH) and D-allose (AlsBAC) are involved in the uptake of D-ribose into cells with low affinity. In case of Als system, its contribution to D-ribose growth is elevated by a point mutation in the negative regulator alsR. Atypical insertions showing an enhanced D-ribose growth were appeared and mapped at xylA and its promoter region. The mutations elevated not only the uptake rate for D-ribose but also the expression of xylFGH encoding high-affinity transporter for D-xylose. Suppressor mutations resulting in the basal growth were obtained in xylF, xylG, and xylR. The elevated level of D-ribose uptake was lowered to basal level both in the presence of D-xylose and by the suppressor mutations. Also, a constitutive expression of xylFGH under $P_{trc}$ promoter enhanced the growth for D-ribose. These results indicate that XylFGH transports D-ribose into cell. The metabolism of D-xylose in Escherichia coli K-12 was known to be mediated by xylAB gene. However, the xylFGH and xylR genes were recently found by genome sequencing and predicted for transport and regulation based on their sequence similarities. The functions and regulation of the xyl genes were also investigated. An analysis with transposon insertions in xyl genes revealed that the xyl genes are organized into two major transcriptional units, xylAB and xylFGHR, under the promoters $P_A$ and $P_F$, respectively. When studied using operon fusions to 'lacZ, both promoters were activated by D-xylose and repressed by glucose. A mutation in xylR completely abolishes the expressions from $P_A$ and $P_F$ promoters, causing defects in both growth and transport. The XylR protein was shown to interact with the xyl promoters at higher affinity in the presence of xylose, suggesting that it positively regulates the transcriptions. In vivo footprinting and primer extension analyses revealed that XylR binds to at least two DNA regions, $I_A$ and $I_F$, each with a direct repeat. Deletion and insertion analysis of xyl promoter region revealed that XylR-binding between two distal loci, an $I_F$ half site ($I_{F1}$) and an upstream region (xylO) spanning from -240 to -270, are involved in negative regulation in the absence of D-xylose, suggesting that the ordered structure under the non-induced condition is formed by DNA looping. A disruption of the negative regulation by transposon insertion or deletion of xylO site induced both the accidental expression of $P_F$ promoter without inducer and exhibition of the cryptic D-ribose transport through XylFGH. The locations of the xyl regulatory sites are consistent with the phenotypes caused by transposon insertions in the promoter regions. From this study, it was implied that uptake of a physiologically important nutrient such as D-ribose occurs through multiple channels based on the stereochemical similarity.
대장균에서 리보스의 수송에는 RbsACB 이외에 다른 수송계들도 관여함이 암시되었다. 즉, 고친화성 리보스 수송계 (RbsACB)가 결핍된 돌연변이체가 리보스를 단일탄소원으로 이용하여 성장할 수 있다. 저친화성 리보스 수송계를 규명하기 위한 전위인자 돌연변이법을 수행하여 리보스에 대한 성장이 달라진 수십 종의 돌연변이체를 $1\times10^{-5}$의 빈도로 분리하였다. 그 삽입전위인자의 정확한 위치를 본 연구의 과정에서 새로이 고안된 in vivo 클로닝법에 의하여 결정하였다. 이들 돌연변이체에 대한 유전학적, 생화학적 연구에 의하여 자일로스 (XylFGH)와 알로스 (AlsBAC)의 고친화성 수송계가 리보스를 세포 안으로 수송할 수 있음이 확인되었다. AlsBAC에 의한 리보스의 수송은 조절유전자 alsR에서의 돌연변이에 의하여 촉진되고, alsBAC에서의 전위인자의 삽입에 의하여 그 기능이 상실되었다. xylA와 그 promoter에서의 전위인자 삽입 돌연변이는 리보스에 대한 성장뿐만 아니라 리보스의 수송과 xylFGH의 발현도 증가시켜주었다. 이 같은 표현형은 자일로스 고친화성 수송계의 구성요소인 xylF와 xylG 및 조절유전자 xylR에서의 이차억제 돌연변이에 의하여 억제되었다. 또한, 증가된 리보스의 수송 속도도 자일로즈와 xylG 돌연변이에 의하여 감소하였다. 즉, xylA와 그 promoter에서의 전위인자 삽입 돌연변이에 의하여 xylFGH의 발현이 가능하게 되어 야생형 균주에서 잠재해있던 리보스에 대한 수송능이 노출된 것으로 판단된다.
자일로즈의 대사는 xylAB가 관여하고, xylFGH와 xylR은 자일로즈의 수송계와 발현조절에 관계하는 유전자로 추측되어왔다. 이들 유전자들은 $P_A$와 $P_F$ promoter로 부터 두개의 전사 단위체로써 발현되고, xylR은 $P_R$에 의하여 발현된다. $P_A$와 $P_F$ promoter의 발현은 xylose에 의하여 활성화되었고 glucose에 의하여 catabolite repression되었다. 조절유전자 xylR의 돌연변이에서 $P_A$와 $P_F$의 발현은 완전히 소멸되었고, xylose에서 대한 성장과 수송에 결함을 보여주었다. 이와 같이 두 promoter는 XylR에 의하여 양성(positive)뿐만 아니라 음성조절(negative regulation)된다. Xylose 부재시의 음성조절에서 XylR은 xylO와 $I_{F1}$ site에 결합하며, xylO site의 제거에 의하여 $P_F$의 발현이 증가하였다. xylose 존재시에는 XylR이 $P_A$와 $P_F$의 각 -35 부위의 바로 위쪽 ($I_A$, $I_F$)에 결합하여 두 promoter의 발현을 촉진한다. 또한, xylF와 xylA 유전자의 발현을 억제하는 인자가 각 구조유전자 내의 특정 염기서열에서 발견되었다. 두 XylR 결합자리($I_A$, $I_F$)는 약 네 회전의 DNA 나선을 차지하며 direct repeat 구조를 보여주는데, 이는 XylR이 dimer로써 전사촉진인자로 작용함을 말해준다. xyl 오페론의 전사관여 인자들(RNA polymerase, XylR과 CRP)의 결합위치는 매우 근접하여 존재하는데, 이는 xyl 유전자들의 발현에 이들 인자간의 상호작용이 필수적임을 말한다.
