Fibrinolysis is performed by the serum protease plasmin (plm), which is normally present in the blood as a precursor, plasminogen (plg). The plg is activated to plm by the plg activators, such as tissue-type plasminogen activator (t-PA) or urokinase-type plasminogen activator (u-PA). Streptokinase (SK), an extracellular protein produced by several strains of (-hemolytic streptococci, also activates plg to plm. SK is currently used as a therapeutic agent in treatment of the thromboembolic blockage, such as myocardial infarction. For the therapeutic use and the functional studies, a high-level expression plasmid for SK, pSK100, has been constructed. It contains a tac promoter, an ompA signal sequence, a SK structural gene (skc) and a rrnBT1T2 transcription terminator. E. coli JM109 carrying pSK100 produced about 5,000IU of SK per 1 ml of LB-ampicillin media. About 95% of the expressed SK were secreted into the periplasmic and extracellular fractions. The recombinant SK in high yield and purity may be a potential alternative source for the therapeutic agent. Because of its peculiar mechanism for plg activation, many researchers have long investigated SK. Unlike most of the plg activators, SK does not have proteolytic activity. It activates plg by the formation of an equimolar complex with plg. The SK-plg complex is an efficient proteolytic activator of plg. However, there are little reports on exact region of SK involved in activator complex formation with plg. In order to elucidate the interaction site or domain of SK with plg, C-terminal truncation analysis of SK was performed by exonuclease III method and PCR method. SK mutants, which lose 26, 33, 37, 40, 41, 46, 47, 50, 70, 97 or 124 amino acid residues from the C-terminus, were constructed. The truncated SKs were expressed in E.coli and purified. The 41 residue deletion (SKP373) from the C-terminus had not effect on the plg activation activity. However, the deletion of 46 amino acid residues (SKP368) resulted in the dramatic reduction of the plg activation efficiency. These results suggest that the C-terminal peptide from Met369 to Pro373 is important in plg activation. At present, it is not clear why the loss of 46 or more amino acids resulted in the reduction in plg-activation efficiency. The peptide has two positively charged residues, Lys371 and Arg372, and is suspected to form a β-turn structure. Furthermore, SKP290 devoid of the peptide did not bind to plg. We suggest that the peptide play an important role in plg activation as a binding site to plg. The two positively charged residues may interact with the negatively charged side chains of plg by electrostatic interaction. On the other hand, we cannot rule out the possibility that the peptide contributes in stabilizing the conformation of the SK molecule. It has been suggested that SK functions by inducing conformational change of plg after formation of equimolar complex with plg. The conformational change of Lys-plg induced by a SK fragment (SKF) was investigated by measuring intrinsic fluorescence. The intrinsic fluorescence signal of Lys-plg and Lys-plm (Lys-plm) consists of a single peak with maximum intensity at 333 nm and 338 nm, respectively. The addition of equimolar SKF, a SK fragment retaining SK activity without any tryptophan residue, shifted emission maximum of plg from 333 nm to 338 nm. This result suggest that SK induces plm-like conformation of plg by forming SK-plg complex. On the other hand, the SKF showed the same activity as native SK in CLN assay method. However, it showed about 20 % of the wild type SK activity in Christensen assay method. This result suggests that the N-terminal region (peptide 1 - 63) of SK plays an important role in the acceleration of plg activation by fibrin. At present, it is not clear why the loss of the peptide resulted in loss of acceleration of plg activation by fibrin. Since, the ε-amino caproic acid (ε-ACA) reduced about 30 % of the fluorescence intensity of nSK-Lys-plg complex and about 10 % of that of the SKF-Lys-plg, we suggest that the N-terminal region (peptide 1 - 63) of SK plays some roles in conformational change of plg by fibrin. However, we can not rule out the possibility of direct interaction of the peptide with fibrin.
혈액 내에서 생성된 혈전은 단백질 가수분해 효소인 플라스민에 의해서 분해되며 플라스민은 혈액 내에서 전구체인 플라스미노젠으로 존재한다. 스트렙토키나아제는 플라스미노젠을 플라스민으로 활성화 시킴으로써 혈전을 분해하며, 현재 혈관내의 혈액응고에 의해 생기는 심근경색 등의 치료제로써 널리 쓰이고 있다. 스트렙토키나아제는 치료제로서의 중요성과 톡특한 작용기작 때문에 널리 연구되어 왔으나, 분자수준에서의 연구 결과는 거의 보고되지 않았다. 본 연구에서는 재조합 스트렙토키나아제의 대량발현 체계를 확립하였고 이를 이용하여 플라스미노젠 활성화에 중요한 부위와 스트렙토키나아제의 결합에 따른 플라스미노젠의 구조변화를 규명하였다. 스트렙토키나아제의 대량발현을 위하여 발현벡터 pSK100을 만들었다. 이 발현벡터는 강력한 tac 촉진제와 ompA 신호서열 그리고 스트렙토키나아제의 구조 유전자를 갖고있다. 이 발현벡터를 갖고있는 대장균은 액체배양에서 1 ml 당 5,000 단위 이상의 스트렙토키나아제를 생산하였으며, 특히 생성된 스트렙토키나아제의 95% 이상이 페리플라즘(periplasm)과 세포 외로 분비되었다. 스트렙토키나아제의 C-말단 부℃㎞L} 플라스미노젠 활성화에 중요하다는 증거들이 있어, C-말단에 대한 순차적 절단을 수행하였다. Exonuclease III와 PCR 방법을 통하여 C-말단으로부터 각각 26, 33, 37, 40, 41, 46, 47, 50, 70, 97, 124 아미노산이 결손된 스트렙토키나아제 유전자를 제조하였고 이를 발현하여 정제하였다. 정제한 결손돌연변이체 스트렙토키나아제의 활성을 조사한 결과 C-말단으로 부터 41개 잔기의 결손은 플라스미노젠 활성화에 거의 영향을 주지 않으나 46개의 잔기가 결손되면 활성이 급격히 감소하였다. 이러한 결과는 스트렙토키나아제의 C-말단의 42번에서 46번째 사이의 잔기들 (펩티드 Met369-Pro373)이 플라스미노젠 활성화에 중요함을 시사한다. 한편, 이 부위가 결손된 SKP290는 플라스노젠에 결합하지 못하였으며, 이차구조 예측결과 이 부위는 양전하를 갖는 두 잔기 (Lys371, Arg372)를 포함하는 $\beta$-turn 구조를 이루고 있다. 이러한 사실로부터 상기의 펩티드 부위는 플라스미노젠 활성화시에 결합부위로 작용할 것으로 사료된다. 스트렙토키나아제는 플라스미노젠에 결합한후 플라스미노젠의 구조변화를 유도함으로써 작용한다고 알려져 왔으나 구체적인 증거는 보고된 바 없다. 본 연구?【？ⓟ 내재성 형광 (intrinsic fluoscence)을 갖지 않는 스트렙토키나아제 단편(SK fragment)을 정제하였고, 이를 이용하여 스트렙토키나아제의 결합에 따른 플라스미노젠의 구조변화를 측정하였다. 라이신 플라스미노젠 (Lys-plg) 과 라이신 플라스민 (Lys-plm)은 각각 333 nm 와 338 nm 에서 최대값을 갖는 내재성 형광 신호 (intrinsic fluorescence signal)를 나타내었다. 라이신 플라스미노젠에 정제한 스트렙토키나아제 단편을 첨가하였을 때 내재성 형광이 최대값을 보이는 파장이 333 nm에서 338 nm로 변하였다. 이 결과는 스트렙토키나아제가 플라스미노젠의 구조를 플라스민과 비슷한 구조로 변화시켰기 때문으로 생각된다. 한편 상기의 스트렙토키나아제 단편은 아미노산 서열분석 결과 N-말단의 63개의 잔기가 결손되어 있었다. 이 스트렙토키나아제 단편의 활성을 측정한 결과 특이하게도 CLN 분석법에서는 야생형 스트렙토키나아제와 거의 같은 활성을 보였으나 Christensen 분석법에서는 야생형의 약 20 % 정도의 활성을 보였다. Christensen 분석법에서는 CLN법과는 달리 플라스민의 기질로서 피브린을 직접 사용한다. 피브린은 플라스미노젠 기질로 사용되며, 플라스미노젠 활성화를 촉진하는 역할도 한다. 이러한 일련의 결과는 스트렙토키나아제의 N-말단 부위 (펩티드 1 - 63)가 피브린에 의한 플라스미노젠 활성화의 촉진작용에 관여함을 시사해 준다. 현재 N-말단 부위 (펩티드 1 - 63)의 구체적인 작용 기작은 명확하지 않다. 그러나 피브린 유사체(analogue)인 $\varepsilon$-amino caproic acid는 스트렙토키나아제-플라스미노젠 복합체의 내재성 형광을 약 30 % 감소 시키는데 반해 스트렙토키나아제 단편의 경우 약 10 % 만 감소 시킨다. 이러한 사실로 보아 스트렙토키나아제의 N-말단 부위 (펩티드 1 -63)가 피브린에 의한 플라스미노젠의 구조변화에 관여 한다고 사료되나 이 펩티드 부위가 직접 피브린과 상호작용 할 가능성도 배제 할 수 는 없다.
